脊髓灰质炎病毒Ⅰ型单克隆抗体的制备
发布时间：2020-12-22 02:33
目的:为建立脊灰病毒Sabin株Ⅰ型特异的单克隆抗体.方法:以Vero细胞增殖病毒并用蔗糖密度梯度离心法纯化后,用病毒免疫SPF级Balb/c小鼠.取小鼠免疫脾淋巴细胞与SP2/0-Ag14骨髓瘤细胞进行细胞融合,通过间接ELISA法筛选抗体阳性的杂交瘤细胞,并用有限稀释法克隆化.用细胞培养法制备脊灰病毒单抗,并以中和试验测定单抗效价.结果:获得了8株分泌抗脊灰病毒Sabin株Ⅰ型单克隆抗体的杂交瘤细胞株,其中1株G8G7能够稳定分泌抗体.间接ELISA法测得单抗的效价为1:8,中和试验测得中和抗体的效价为1:58.结论:G8G7分泌的抗体为抗脊灰病毒Sabin株Ⅰ型特异的单克隆抗体.
【文章来源】：中南民族大学学报(自然科学版). 2018年04期
【文章页数】：5 页
【部分图文】：
形态;b)细胞完全病变形态图1脊灰病毒致细胞病变效应a)正常细胞
胞完全CPE，细胞折光性增强，胞内颗粒增多，细胞收缩，由梭形逐渐变为圆形，细胞间只有纤细的细胞间桥连接，细胞单层出现拉网结构，融合成片(见图1b)．a)正常细胞形态;b)细胞完全病变形态图1脊灰病毒致细胞病变效应Fig．1CPEofpoliovirus2．2效价测定将收获的病毒原液经过PEG浓缩后，测定每个批次病毒效价．第1～6d，I型脊灰病毒原液的效价和浓缩毒液的效价存在显著差异．终点效价，其中I型10倍和500倍浓缩毒液的效价均显著高于原液的效价(P＜0．05，见图2)．与I型原液相比，*P＜0．05，＊＊P＜0．01，n=3图2脊灰病毒I型效价测定Fig．2TiterdeterminationofpoliovirustypeI2．3脊灰病毒Sabin株I型VP1基因的扩增针对I型病毒结构蛋白VP1的编码区设计的引物UG1和UC11，通过逆转录PCＲ扩增后，产生约1100bp的特异性产物，经琼脂糖凝胶电泳后，在1100第4期王朝元，等:脊髓灰质炎病毒I型单克隆抗体的制备73
bp处各有一条明亮的脊灰病毒VP1基因的特异性条带，460bp处为试剂盒阳性对照条带，1100bp处为目的条带(见图3)，其表明逆转录扩增成功，初步确定病毒为脊髓灰质炎病毒．M)DNA标准品;PC)阳性对照;1，2，3)I型脊灰病毒样品图3脊灰病毒Sabin株I型VP1基因ＲT-PCＲ扩增产物Fig．3ＲT-PCＲamplificationproductofVP1genefrompoliovirusSabintypeI2．4病毒纯化蛋白含量及SDS-PAGE图谱经过蔗糖(质量比为15%～50%)密度梯度离心，及50%，30%蔗糖垫层离心后，培养的脊灰病毒纯化效果一般，其蛋白含量为2．764mg/mL．脊灰病毒的3种结构蛋白VP1，VP2，VP3在SDS-PAGE图谱上可见分子量分别为35，28，24KDa．M)蛋白标准品;1)纯化病毒的衣壳蛋白图4纯化脊灰病毒衣壳蛋白SDS-PAGE结果Fig．4SDS-PAGEresultofVPsfrompurifiedpoliovirus2．5细胞融合及阳性杂交瘤细胞建株细胞融合后，第3d出现几个浑圆透亮正在生长的杂交瘤细胞;第5～6d出现多个成葡萄串状分布的融合细胞集落;生长至第8d时，融合细胞集落继续长大，有肉眼可见针尖样大小的集落;约第12d，细胞集落可布满每孔1/3～1/2的面积，培养液颜色呈黄色，此时可进行抗体筛选(见图5)．共进行6次细胞融合，铺29块96孔细胞培养板，6次的细胞融合率分别为15．63%，3．12%，66．49%，33．33%，46．65%，14．21%;筛选到8株阳性杂交瘤细胞，经过3次有限稀释克隆化后，得到1株稳定分泌脊灰病毒I型抗体的杂交瘤细胞株G8G7．a)3d;b)5d;c)8d;d)12d
【参考文献】：
期刊论文
[1]bHGA对体外培养成骨细胞活性的影响[J]. 王朝元,刘亮亮. 中南民族大学学报(自然科学版). 2016(02)
[2]脊髓灰质炎病毒2型和3型D抗原单克隆抗体的制备及鉴定[J]. 张春梅,宋朝君,李娜,董芸,田莹,张赟,金伯泉,李琦. 细胞与分子免疫学杂志. 2014(11)
[3]抗Ⅰ型脊髓灰质炎病毒单克隆抗体的制备[J]. 李树香,沈心亮,石男,刘敬. 中国生物制品学杂志. 2010(06)
[4]中国2009年Ⅰ型脊髓灰质炎病毒基因特征分析[J]. 安军静,朱晖,严冬梅,张勇,王冬艳,祝双利,许文波. 中国疫苗和免疫. 2010(02)
[5]羊轮状病毒LLR VP4单克隆抗体的制备与特性研究[J]. 王三应,孙萍萍,张磊,张翌,李莎,李燕,杨继红. 中国人兽共患病学报. 2009(11)
[6]抗脊髓灰质炎病毒Ⅱ型Sabin株D抗原单克隆抗体的研制[J]. 褚学者,姜述德,孙明波,周铁群,方捍华,杨建勇,张新文,潘玥,李卫东,廖国阳. 免疫学杂志. 2006(04)
[7]抗脊髓灰质炎病毒单克隆抗体试剂盒的研制及应用[J]. 唐恩华,庄俊英,王立言,刘名英,王宪焘,谢天宏,文喻玲,阮永良,秦红星,郭仁. 中国生物制品学杂志. 1991(02)
本文编号：2930975
【文章来源】：中南民族大学学报(自然科学版). 2018年04期
【文章页数】：5 页
【部分图文】：
形态;b)细胞完全病变形态图1脊灰病毒致细胞病变效应a)正常细胞
胞完全CPE，细胞折光性增强，胞内颗粒增多，细胞收缩，由梭形逐渐变为圆形，细胞间只有纤细的细胞间桥连接，细胞单层出现拉网结构，融合成片(见图1b)．a)正常细胞形态;b)细胞完全病变形态图1脊灰病毒致细胞病变效应Fig．1CPEofpoliovirus2．2效价测定将收获的病毒原液经过PEG浓缩后，测定每个批次病毒效价．第1～6d，I型脊灰病毒原液的效价和浓缩毒液的效价存在显著差异．终点效价，其中I型10倍和500倍浓缩毒液的效价均显著高于原液的效价(P＜0．05，见图2)．与I型原液相比，*P＜0．05，＊＊P＜0．01，n=3图2脊灰病毒I型效价测定Fig．2TiterdeterminationofpoliovirustypeI2．3脊灰病毒Sabin株I型VP1基因的扩增针对I型病毒结构蛋白VP1的编码区设计的引物UG1和UC11，通过逆转录PCＲ扩增后，产生约1100bp的特异性产物，经琼脂糖凝胶电泳后，在1100第4期王朝元，等:脊髓灰质炎病毒I型单克隆抗体的制备73
bp处各有一条明亮的脊灰病毒VP1基因的特异性条带，460bp处为试剂盒阳性对照条带，1100bp处为目的条带(见图3)，其表明逆转录扩增成功，初步确定病毒为脊髓灰质炎病毒．M)DNA标准品;PC)阳性对照;1，2，3)I型脊灰病毒样品图3脊灰病毒Sabin株I型VP1基因ＲT-PCＲ扩增产物Fig．3ＲT-PCＲamplificationproductofVP1genefrompoliovirusSabintypeI2．4病毒纯化蛋白含量及SDS-PAGE图谱经过蔗糖(质量比为15%～50%)密度梯度离心，及50%，30%蔗糖垫层离心后，培养的脊灰病毒纯化效果一般，其蛋白含量为2．764mg/mL．脊灰病毒的3种结构蛋白VP1，VP2，VP3在SDS-PAGE图谱上可见分子量分别为35，28，24KDa．M)蛋白标准品;1)纯化病毒的衣壳蛋白图4纯化脊灰病毒衣壳蛋白SDS-PAGE结果Fig．4SDS-PAGEresultofVPsfrompurifiedpoliovirus2．5细胞融合及阳性杂交瘤细胞建株细胞融合后，第3d出现几个浑圆透亮正在生长的杂交瘤细胞;第5～6d出现多个成葡萄串状分布的融合细胞集落;生长至第8d时，融合细胞集落继续长大，有肉眼可见针尖样大小的集落;约第12d，细胞集落可布满每孔1/3～1/2的面积，培养液颜色呈黄色，此时可进行抗体筛选(见图5)．共进行6次细胞融合，铺29块96孔细胞培养板，6次的细胞融合率分别为15．63%，3．12%，66．49%，33．33%，46．65%，14．21%;筛选到8株阳性杂交瘤细胞，经过3次有限稀释克隆化后，得到1株稳定分泌脊灰病毒I型抗体的杂交瘤细胞株G8G7．a)3d;b)5d;c)8d;d)12d
【参考文献】：
期刊论文
[1]bHGA对体外培养成骨细胞活性的影响[J]. 王朝元,刘亮亮. 中南民族大学学报(自然科学版). 2016(02)
[2]脊髓灰质炎病毒2型和3型D抗原单克隆抗体的制备及鉴定[J]. 张春梅,宋朝君,李娜,董芸,田莹,张赟,金伯泉,李琦. 细胞与分子免疫学杂志. 2014(11)
[3]抗Ⅰ型脊髓灰质炎病毒单克隆抗体的制备[J]. 李树香,沈心亮,石男,刘敬. 中国生物制品学杂志. 2010(06)
[4]中国2009年Ⅰ型脊髓灰质炎病毒基因特征分析[J]. 安军静,朱晖,严冬梅,张勇,王冬艳,祝双利,许文波. 中国疫苗和免疫. 2010(02)
[5]羊轮状病毒LLR VP4单克隆抗体的制备与特性研究[J]. 王三应,孙萍萍,张磊,张翌,李莎,李燕,杨继红. 中国人兽共患病学报. 2009(11)
[6]抗脊髓灰质炎病毒Ⅱ型Sabin株D抗原单克隆抗体的研制[J]. 褚学者,姜述德,孙明波,周铁群,方捍华,杨建勇,张新文,潘玥,李卫东,廖国阳. 免疫学杂志. 2006(04)
[7]抗脊髓灰质炎病毒单克隆抗体试剂盒的研制及应用[J]. 唐恩华,庄俊英,王立言,刘名英,王宪焘,谢天宏,文喻玲,阮永良,秦红星,郭仁. 中国生物制品学杂志. 1991(02)
本文编号：2930975
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