新城疫病毒HBNU/LSRC/F3株HN基因真核表达及其编码蛋白的抗肿瘤功能研究
发布时间：2020-12-22 14:21
目的在人食管癌ECA109细胞中表达新城疫病毒HBNU/LSRC/F3株HN基因,观察其编码蛋白的抗肿瘤特性。方法提取新城疫病毒总RNA,以根据HN基因开放阅读框（登录号为KC246549.1）和真核表达载体C-flag pcDNA3的多克隆位点设计的带酶切位点引物通过逆转录PCR（RT-PCR）扩增HN基因,然后连接到真核表达载体上,测序正确的重组质粒转染ECA109细胞,运用免疫荧光及RT-PCR检验HN基因的表达,通过流式细胞术检测其表达产物的抗肿瘤效果。结果 HN基因正确连接到真核表达载体C-flag pcDNA3上,测序显示HN基因序列与GenBank上已发表的HBNU/LSRC/F3株的HN序列一致。重组质粒转染ECA109细胞36h后,其胞质内可见黄绿色荧光,转染48h后扩增到HN基因,而空质粒转染细胞扩增阴性。经流式细胞术检测,重组质粒转化肿瘤细胞凋亡率为（8.2±1.56）%,空质粒对照组为（4.6±0.83）%,差异有统计学意义（P<0.05）。结论 HN基因重组质粒转化ECA109细胞表达HN蛋白,该蛋白具有一定的抗肿瘤活性。
【文章来源】：中国病原生物学杂志. 2016年10期 北大核心
【文章页数】：5 页
【部分图文】：
图１ＨＮ基因的ＰＣＲ扩增Ｍ２０００ｂｐｍａｒｋｅｒ１－３ＨＮｇｅｎｅＭ２０００ｂｐＤＮＡ标志物１～３ＨＮＰＣＲ产物
鉴定，扩增片段约为１７１６ｂｐ，与目的基因片段大小相符（图１）。Ｍ２０００ｂｐＤＮＡ标志物１～３ＨＮＰＣＲ产物图１ＨＮ基因的ＰＣＲ扩增Ｍ２０００ｂｐｍａｒｋｅｒ１－３ＨＮｇｅｎｅＦｉｇ．１ＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＨＮｇｅｎｅ２ｃ－ＦｌａｇｐｃＤＮＡ３－ＨＮ重组质粒的构建与鉴定将连接产物转化Ｅ．ｃｏｌｉＴＯＰ１０感受态细胞接种于含氨苄青霉素的ＬＢ固体平板上，次日取单个阳性克隆菌落为模版进行ＰＣＲ，扩增片段约１７１６ｂｐ大小的片段（图２）。阳性克隆质粒经ＨｉｎｄⅢ和ＢａｍＨⅠ双酶切，获得１７１６ｂｐ和５．４ｋｂ左右两条片段，与目的片段和载体片段长度大小相符（图３）。重组质粒测序分析显示插入ＨＮ基因片段与ＧｅｎＢａｎｋ上报道的新城疫病毒ＨＢＮＵ／ＬＳＲＣ／Ｆ３株序列一致性为１００％。３重组质粒转染细胞的ＲＴ－ＰＣＲ验证测序正确的阳性重组质粒通过脂质体转染的方法转染人食管癌细胞ＥＣＡ１０９细胞，３６ｈ后提取细胞总ＲＮＡ，逆转录为ｃＤＮＡ，采用ＲＴ－ＰＣＲ检测β－ａｃｔｉｎ、ＨＮ基因，结果见图４。重组质粒转染ＥＣＡ１０９细胞扩增出６１３ｂｐ的β－ａｃｔｉｎ和约１７１６的ＨＮ基因，空质粒转化对照仅扩增出６１３ｂｐ的β－ａｃｔｉｎ。Ｍ４５００ｂｐＤＮＡ标志物１、２ｃ－ＦｌａｇｐｃＤＮＡ－ＨＮ转化菌ＰＣＲ产物图２重组质粒转化菌菌落ＰＣＲ鉴定Ｍ４５００ｂｐｍａｒｋｅｒ１，２Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｌａｓｍｉｄｃ－
４转染ＥＣＡ１０９细胞ＨＮ蛋白的表达间接免疫荧光法检测显示转染重组质粒的ＥＣＡ１０９细胞胞质内可见黄绿色荧光，而空质粒组细胞胞质内无特异荧光（图５）。Ａｃ－ｆｌａｇ－ｐｃＤＮＡ３－ＨＮ重组质粒转染ＥＣＡ细胞Ｂｃ－ｆｌａｇ－ｐｃＤ－ＮＡ３空质粒转染对照图５间接免疫荧光法测ＨＮ蛋白的表达Ａｃ－ｆｌａｇ－ｐｃＤＮＡ３ｐｌａｓｍｉｄｇｒｏｕｐＢｃ－ｆｌａｇ－ｐｃＤＮＡ３－ＨＮｐｌａｓｍｉｄｇｒｏｕｐＦｉｇ．５ＡｓｓａｙｒｅｓｕｌｔｓｏｆＨＮｐｒｏｔｅｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎＥＣＡ１０９ｃｅｌｌｓ５重组质粒转染细胞后的凋亡情况流式细胞仪检测重组质粒转染ＥＣＡ１０９细胞４８ｈ后的凋亡率为（８．２±１．５６）％，空质粒转染对照为（４．６±０．８３）％，空白对照为（１．０±０．３３）％，差异有统计学意义（Ｐ＜０．０５）（图６）。Ａｃ－ｆｌａｇ－ｐｃＤＮＡ３－ＨＮ重组质粒转染细胞Ｂｃ－ｆｌａｇ－ｐｃＤＮＡ３空质粒转染对照图６流式细胞仪检测重组质粒转染ＥＣＡ１０９的凋亡率（％）Ａｃ－ｆｌａｇ－ｐｃＤＮＡ３ｐｌａｓｍｉｄｇｒｏｕｐＢｃ－ｆｌａｇ－ｐｃＤＮＡ３－ＨＮｐｌａｓ－ｍｉｄｇｒｏｕｐＦｉｇ．６ＡｐｏｐｔｏｔｉｃＥｆｆｅｃｔｏｆＥＣＡ１０９ｃｅｌｌｓｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄｂｙｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｌａｓｍｉｄｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙＡｎｎｅｘｉｎＶ／ＰＩｄｏｕｂｌｅｓｔａｉｎｆｌｏｗｃｙｔｍｅｔｒｙ讨论肿瘤免疫治疗的目的是加强免疫系统潜在的识别和清除肿瘤细胞的能力，而这些能力通过Ｔ细胞、ＮＫ细胞、ＮＫＴ细胞、Ｂ细
【参考文献】：
期刊论文
[1]7株野鸟源新城疫病毒F基因和HN基因遗传变异分析[J]. 李胜楠,王海军,高晓龙,李元果,国娇,陈迪,王铁成,于志君,高玉伟,夏咸柱,王全凯. 中国病原生物学杂志. 2015(12)
[2]新城疫病毒NP和P基因辅助质粒的构建及鉴定[J]. 陈兴,阎富龙,徐一鸣,赵权,肖朋朋,郭海宁,靖杰,辛舒,鲁会军,金宁一. 中国病原生物学杂志. 2014(06)
[3]稳定表达狂犬病毒糖蛋白的重组新城疫病毒对人肺腺癌A549细胞荷瘤鼠瘤体生长的影响[J]. 贾丽娟,刘洋,张金,梁冰,张杰,严玉兰. 江苏大学学报(医学版). 2014(02)
[4]新城疫病毒诱导人食管癌细胞ECA-109凋亡的体外研究[J]. 王静,董尚林,卢志红,刘进军,孙黎,刘开扬. 山东医药. 2011(21)
[5]Activity of T Cells Stimulated by Hemagglutinin-neuraminidase of Newcastle Disease Virus in vivo[J]. PIAO Bing-guo1,2,5, LI Xiao2,3, SUN Li-li2,4, KAN Shi-fu2,3, LIU Lei1,2, HUANG Hai-yan1,2, YANG Guo-hua1,2, WANG Yu-hang2,3, WANG Zhuo-yue2,3, SUN Jiu-hua2,5, PIAO Yun-feng1,2 and JIN Ning-yi2,3* 1. The First Hospital of Jilin University, Changchun 130021, P. R. China; 2. Genetic Engineering Laboratory of PLA, 3. Key Laboratory of Jilin Province for Zoonosis Prevention and Control, Military Veterinary Institute, Academy of Military Medical Sciences of PLA, Changchun 130062, P. R. China; 4. Head and Neck Surgery, Tumor Hospital of Jilin Province, Changchun 130001, P. R. China; 5. Department of Gastroenterology, 209 Hospital of PLA, Mudanjiang 157000, P. R. China. Chemical Research in Chinese Universities. 2011(03)
[6]定位表达的新城疫病毒HN蛋白对荷瘤小鼠的抗肿瘤免疫作用[J]. 王凯冰,隋红,李乐静,李曦,王磊. 中国肺癌杂志. 2010(08)
[7]Construction and anti-tumor effects of recombinant fowlpox virus expressing Newcastle disease virus hemagglutinin-neuramidinase gene[J]. LI Xiao, JIN Ningyi, LIAN Hai, GUAN Goufang, SUN Lili, LI Xuemei & ZHENG Hongling Genetic Engineering Laboratory of PLA, The Eleventh Institute of Academy of Military Medical Sciences of PLA, Changchun 130062, China; Faculty of Agriculture Sciences of Jilin University, Changchun 130062, China; The Second Hospital, Bethune Faculty of Medical Sciences of Jilin University, Changchun 130041, China. Chinese Science Bulletin. 2006(22)
[8]新城疫病毒感染体外诱导胃癌细胞热休克蛋白70的表达及意义[J]. 刘开扬,戴洁,刘春霞,孙黎,刘芳,郭海燕. 肿瘤防治杂志. 2003(05)
本文编号：2931908
【文章来源】：中国病原生物学杂志. 2016年10期 北大核心
【文章页数】：5 页
【部分图文】：
图１ＨＮ基因的ＰＣＲ扩增Ｍ２０００ｂｐｍａｒｋｅｒ１－３ＨＮｇｅｎｅＭ２０００ｂｐＤＮＡ标志物１～３ＨＮＰＣＲ产物
鉴定，扩增片段约为１７１６ｂｐ，与目的基因片段大小相符（图１）。Ｍ２０００ｂｐＤＮＡ标志物１～３ＨＮＰＣＲ产物图１ＨＮ基因的ＰＣＲ扩增Ｍ２０００ｂｐｍａｒｋｅｒ１－３ＨＮｇｅｎｅＦｉｇ．１ＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＨＮｇｅｎｅ２ｃ－ＦｌａｇｐｃＤＮＡ３－ＨＮ重组质粒的构建与鉴定将连接产物转化Ｅ．ｃｏｌｉＴＯＰ１０感受态细胞接种于含氨苄青霉素的ＬＢ固体平板上，次日取单个阳性克隆菌落为模版进行ＰＣＲ，扩增片段约１７１６ｂｐ大小的片段（图２）。阳性克隆质粒经ＨｉｎｄⅢ和ＢａｍＨⅠ双酶切，获得１７１６ｂｐ和５．４ｋｂ左右两条片段，与目的片段和载体片段长度大小相符（图３）。重组质粒测序分析显示插入ＨＮ基因片段与ＧｅｎＢａｎｋ上报道的新城疫病毒ＨＢＮＵ／ＬＳＲＣ／Ｆ３株序列一致性为１００％。３重组质粒转染细胞的ＲＴ－ＰＣＲ验证测序正确的阳性重组质粒通过脂质体转染的方法转染人食管癌细胞ＥＣＡ１０９细胞，３６ｈ后提取细胞总ＲＮＡ，逆转录为ｃＤＮＡ，采用ＲＴ－ＰＣＲ检测β－ａｃｔｉｎ、ＨＮ基因，结果见图４。重组质粒转染ＥＣＡ１０９细胞扩增出６１３ｂｐ的β－ａｃｔｉｎ和约１７１６的ＨＮ基因，空质粒转化对照仅扩增出６１３ｂｐ的β－ａｃｔｉｎ。Ｍ４５００ｂｐＤＮＡ标志物１、２ｃ－ＦｌａｇｐｃＤＮＡ－ＨＮ转化菌ＰＣＲ产物图２重组质粒转化菌菌落ＰＣＲ鉴定Ｍ４５００ｂｐｍａｒｋｅｒ１，２Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｌａｓｍｉｄｃ－
４转染ＥＣＡ１０９细胞ＨＮ蛋白的表达间接免疫荧光法检测显示转染重组质粒的ＥＣＡ１０９细胞胞质内可见黄绿色荧光，而空质粒组细胞胞质内无特异荧光（图５）。Ａｃ－ｆｌａｇ－ｐｃＤＮＡ３－ＨＮ重组质粒转染ＥＣＡ细胞Ｂｃ－ｆｌａｇ－ｐｃＤ－ＮＡ３空质粒转染对照图５间接免疫荧光法测ＨＮ蛋白的表达Ａｃ－ｆｌａｇ－ｐｃＤＮＡ３ｐｌａｓｍｉｄｇｒｏｕｐＢｃ－ｆｌａｇ－ｐｃＤＮＡ３－ＨＮｐｌａｓｍｉｄｇｒｏｕｐＦｉｇ．５ＡｓｓａｙｒｅｓｕｌｔｓｏｆＨＮｐｒｏｔｅｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎＥＣＡ１０９ｃｅｌｌｓ５重组质粒转染细胞后的凋亡情况流式细胞仪检测重组质粒转染ＥＣＡ１０９细胞４８ｈ后的凋亡率为（８．２±１．５６）％，空质粒转染对照为（４．６±０．８３）％，空白对照为（１．０±０．３３）％，差异有统计学意义（Ｐ＜０．０５）（图６）。Ａｃ－ｆｌａｇ－ｐｃＤＮＡ３－ＨＮ重组质粒转染细胞Ｂｃ－ｆｌａｇ－ｐｃＤＮＡ３空质粒转染对照图６流式细胞仪检测重组质粒转染ＥＣＡ１０９的凋亡率（％）Ａｃ－ｆｌａｇ－ｐｃＤＮＡ３ｐｌａｓｍｉｄｇｒｏｕｐＢｃ－ｆｌａｇ－ｐｃＤＮＡ３－ＨＮｐｌａｓ－ｍｉｄｇｒｏｕｐＦｉｇ．６ＡｐｏｐｔｏｔｉｃＥｆｆｅｃｔｏｆＥＣＡ１０９ｃｅｌｌｓｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄｂｙｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｌａｓｍｉｄｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙＡｎｎｅｘｉｎＶ／ＰＩｄｏｕｂｌｅｓｔａｉｎｆｌｏｗｃｙｔｍｅｔｒｙ讨论肿瘤免疫治疗的目的是加强免疫系统潜在的识别和清除肿瘤细胞的能力，而这些能力通过Ｔ细胞、ＮＫ细胞、ＮＫＴ细胞、Ｂ细
【参考文献】：
期刊论文
[1]7株野鸟源新城疫病毒F基因和HN基因遗传变异分析[J]. 李胜楠,王海军,高晓龙,李元果,国娇,陈迪,王铁成,于志君,高玉伟,夏咸柱,王全凯. 中国病原生物学杂志. 2015(12)
[2]新城疫病毒NP和P基因辅助质粒的构建及鉴定[J]. 陈兴,阎富龙,徐一鸣,赵权,肖朋朋,郭海宁,靖杰,辛舒,鲁会军,金宁一. 中国病原生物学杂志. 2014(06)
[3]稳定表达狂犬病毒糖蛋白的重组新城疫病毒对人肺腺癌A549细胞荷瘤鼠瘤体生长的影响[J]. 贾丽娟,刘洋,张金,梁冰,张杰,严玉兰. 江苏大学学报(医学版). 2014(02)
[4]新城疫病毒诱导人食管癌细胞ECA-109凋亡的体外研究[J]. 王静,董尚林,卢志红,刘进军,孙黎,刘开扬. 山东医药. 2011(21)
[5]Activity of T Cells Stimulated by Hemagglutinin-neuraminidase of Newcastle Disease Virus in vivo[J]. PIAO Bing-guo1,2,5, LI Xiao2,3, SUN Li-li2,4, KAN Shi-fu2,3, LIU Lei1,2, HUANG Hai-yan1,2, YANG Guo-hua1,2, WANG Yu-hang2,3, WANG Zhuo-yue2,3, SUN Jiu-hua2,5, PIAO Yun-feng1,2 and JIN Ning-yi2,3* 1. The First Hospital of Jilin University, Changchun 130021, P. R. China; 2. Genetic Engineering Laboratory of PLA, 3. Key Laboratory of Jilin Province for Zoonosis Prevention and Control, Military Veterinary Institute, Academy of Military Medical Sciences of PLA, Changchun 130062, P. R. China; 4. Head and Neck Surgery, Tumor Hospital of Jilin Province, Changchun 130001, P. R. China; 5. Department of Gastroenterology, 209 Hospital of PLA, Mudanjiang 157000, P. R. China. Chemical Research in Chinese Universities. 2011(03)
[6]定位表达的新城疫病毒HN蛋白对荷瘤小鼠的抗肿瘤免疫作用[J]. 王凯冰,隋红,李乐静,李曦,王磊. 中国肺癌杂志. 2010(08)
[7]Construction and anti-tumor effects of recombinant fowlpox virus expressing Newcastle disease virus hemagglutinin-neuramidinase gene[J]. LI Xiao, JIN Ningyi, LIAN Hai, GUAN Goufang, SUN Lili, LI Xuemei & ZHENG Hongling Genetic Engineering Laboratory of PLA, The Eleventh Institute of Academy of Military Medical Sciences of PLA, Changchun 130062, China; Faculty of Agriculture Sciences of Jilin University, Changchun 130062, China; The Second Hospital, Bethune Faculty of Medical Sciences of Jilin University, Changchun 130041, China. Chinese Science Bulletin. 2006(22)
[8]新城疫病毒感染体外诱导胃癌细胞热休克蛋白70的表达及意义[J]. 刘开扬,戴洁,刘春霞,孙黎,刘芳,郭海燕. 肿瘤防治杂志. 2003(05)
本文编号：2931908
本文链接：https://www.wllwen.com/xiyixuelunwen/2931908.html
