人源化抗HER3单链抗体基因库的构建及筛选

发布时间：2017-04-08 19:30

  本文关键词：人源化抗HER3单链抗体基因库的构建及筛选，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：HER3与HER2同属EGFR (epidermal growth factor receptor)家族的重要成员，同为跨膜酪氨酸激酶受体(RTK)，其与多种人类癌症的形成、进展有关。研究发现HER3蛋白与HER2蛋白的表达高度相关，HER3是辅助HER2形成异源二聚体及致癌作用的重要因子之一。在乳腺癌患者中，HER2、HER3阳性率分别达到50%、41.8%。当乳腺癌患者HER3、HER2同为阳性时，其对HER2靶向药物曲妥珠单抗（Herceptin）的反应效果不佳。因而，通过抑制或阻断体内HER3水平，可能是治疗乳腺癌等癌症的一种重要途径。 【目的】 本研究采用人源化抗体库构建及筛选新思路，即将免疫后的鼠源VH-CDR3库(librare of CDR3of variable region of the murine heavy chain)移植到修饰后的人源scFv(single-chain antibody fragment)框架上，构建抗HER3人源化单链抗体基因库，并对该人源化抗体基因库进行筛选，以期获得具有潜在应用价值的抗HER3人源化单链抗体。另一方面拟通过本论文的实施，建立一种新的人源化抗体筛选技术，为快速获得人源化抗体提供一个新参考。 【方法】 1.人源化抗体基因库构建：采用HER3抗原免疫Balb/c小鼠，当抗血清效价达到1：200000时，从被免疫的小鼠脾细胞中提取总RNA，经反转录PCR（RT-PCR）获得总cDNA。以总cDNA作为模板，采用兼并引物进行PCR扩增，从而获得鼠抗体重链可变区基因库（VH），然后再以VH为模板，扩增出鼠VH-CDR3基因库。将鼠VH-CDR3库通过PCR扩增技术移植到经过修饰的人源单链抗体VH3-VΚ1上，，实现抗HER3人源化抗体基因库的构建。 2.核糖体展示技术富集筛选：针对HER3抗原，经三轮兔网红细胞核糖体展示富集抗HER3的单链抗体基因。为便于后续基因库的高效克隆和表达，对回收的人源化抗体库进行基因结构单元的改进，即在基因库的N-端添加T7启动子、SD序列、PelB等表达原件，C-末端添加携带2个(His)6标签的序列，构建可直接用于TA克隆和表达目标蛋白的人源化抗HER3单链抗体基因库。 3.人源化抗体筛选与鉴定：展示后回收的HER3单链抗体基因库通过TA克隆，转化至大肠杆菌BL21（DE3），用菌落PCR鉴定克隆。分别用HER3抗原和抗VH3-VΚ1兔多克隆抗体等对筛到的阳性克隆的可溶性表达产物进行ELISA筛选，随之对亲和力较高的菌株表达产物进行纯化并测定其亲和常数。 【结果】 本研究成功构建了一个库容达1012的人源化抗HER3单链抗体基因库，经过三轮核糖体展示对抗HER3抗体基因库进行了富集，通过改良的TA克隆技术对目标基因库进行了克隆、表达以及产物鉴定。通过对亲和力较高菌株的表达产物进行纯化并测定其亲和常数，成功获得亲和力达3.02110-8M的人源化抗HER3单链抗体。 【结论】 本研究为开发抗HER3抗体新药研究提供了有价值的先导抗体分子。此外，通过本课题的执行，建立了一种快速筛选人源化单链抗体的新技术途径，从而为其它人源化抗体的筛选提供一个有价值的参考。
【关键词】：HER3蛋白 人源化抗体基因库构建 改良TA克隆技术 抗HER3单链抗体
【学位授予单位】：四川抗菌素工业研究所
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R392
【目录】：

• 摘要7-8
• Abstract8-10
• 1 引言10-13
• 1.1 人源化抗体10-11
• 1.1.1 人源化抗体研究背景10
• 1.1.2 人源化技术研究进展10-11
• 1.2 HER3 靶标简介11-12
• 1.3 单链抗体发展现况12-13
• 1.4 改良的 TA 克隆技术简介13
• 2 抗 HER3 人源化单链抗体基因库构建13-37
• 2.1 前言13-14
• 2.2 实验材料14-17
• 2.2.1 实验仪器14
• 2.2.2 主要试剂14-15
• 2.2.3 引物设计及合成15-16
• 2.2.4 溶液配置16-17
• 2.3 实验方法17-32
• 2.3.1 HER3 抗原免疫小鼠及效价检测18-19
• 2.3.2 鼠源 cDNA 的制备19-21
• 2.3.2.1 淋巴细胞的分离19-20
• 2.3.2.2 鼠总细胞 RNA 的提取20-21
• 2.3.2.3 鼠 cDNA 的合成21
• 2.3.3 抗 HER3 人源化抗体基因库的建立21-24
• 2.3.3.1 鼠源 VH-CDR3 基因库制备21-22
• 2.3.3.2 人源 scFv 抗体框架区基因模板制备22-23
• 2.3.3.3 人源化抗 HER3 抗体基因库制备23-24
• 2.3.4 核糖体展示筛选人源抗体基因库24-27
• 2.3.5 表达型人源化单链抗体基因库制备27-29
• 2.3.5.1 基因库 N-末端表达调控序列 RTST7 domain 制备27
• 2.3.5.2 基因库 C-末端带 His 标签的 TA terminal 序列27-28
• 2.3.5.3 第三轮展示回收的 PCR 产物添加 TA 接头28
• 2.3.5.4 具有表达功能的 anti-HER3 scFv 基因库构建28-29
• 2.3.6 人源化抗 HER3 单链抗体库鉴定29-32
• 2.3.6.1 目标基因库测序29-31
• 2.3.6.2 酶切鉴定目的基因片段插入31
• 2.3.6.3 蛋白表达水平检测基因库的质量31-32
• 2.4 实验结果32-37
• 2.4.1 HER3 蛋白免疫小鼠效价检测32-33
• 2.4.2 总 RNA 提取结果33
• 2.4.3 抗 HER3 人源化抗体基因库的构建33-34
• 2.4.4 核糖体展示富集目的基因序列34
• 2.4.5 表达型人源化单链抗体基因库构建34-35
• 2.4.6 抗 HER3 人源化单链抗体基因库鉴定和初表达35-37
• 2.4.6.1 基因库库容估算35
• 2.4.6.2 酶切检测35-36
• 2.4.6.3 基因库测序检测36
• 2.4.6.4 目标抗体的表达鉴定36-37
• 2.5 小结37
• 3 抗 HER3 人源化 SCFV 抗体筛选及亲和常数测定37-49
• 3.1 前言37-38
• 3.2 实验材料38-41
• 3.2.1 实验仪器38
• 3.2.2 主要试剂38
• 3.2.3 溶液配置38-41
• 3.3 实验方法41-44
• 3.3.1 菌落 PCR 对阳性克隆进行鉴定41
• 3.3.2 阳性菌抗体可溶性表达41-42
• 3.3.3 HER3 抗原和抗 VH3-VΚ1 兔多抗筛选目标抗体42
• 3.3.4 高活性菌株测序验证42-43
• 3.3.5 抗 HER3 scFv 的初步纯化43-44
• 3.3.6 间接 ELISA 鉴定纯化样品抗原结合活性44
• 3.3.7 筛选的高亲和力抗 HER3 scFv 亲和常数测定44
• 3.4 实验结果44-48
• 3.4.1 菌落 PCR 检测阳性克隆44-45
• 3.4.2 HER3 抗原和兔多抗筛选结果45
• 3.4.3 测序验证45-46
• 3.4.4 样品纯化结果检测46-47
• 3.4.5 间接 ELISA 鉴定纯化样品结合活性47-48
• 3.4.6 抗 HER3-236 scFv 抗体亲和常数测定48
• 3.5 小结48-49
• 4.讨论49-50
• 参考文献50-53
• 致谢53
• 作者在读期间科研成果简介53-54
• 综述：人源抗体的研究进展54-67
• 参考文献64-67

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  本文关键词：人源化抗HER3单链抗体基因库的构建及筛选，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：293556