伤寒多糖结合疫苗的生物合成研究

发布时间：2017-04-09 05:00

  本文关键词：伤寒多糖结合疫苗的生物合成研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：伤寒沙门氏菌(Salmonella enterica subspecies enterica serotype Typhi)是引发人类急性肠道传染病伤寒的病原菌,具有强的侵袭性,产生内毒素,由粪-口途径传播。伤寒是一种以发热为主要表现的全身性疾病,曾在世界各地流行。随着生活卫生条件的改善和抗生素(特别是氯霉素)的使用,伤寒的发病率与其导致的死亡率在发达国家有大幅度的下降,而在亚非拉的一些发展中国家依旧是一个重要的公共卫生问题。伤寒的常规治疗方式是抗生素疗法,但抗生素的长期使用造成了伤寒菌多重耐药株的产生。而接种疫苗,是除了改善卫生条件之外最有效的预防和控制手段,目前在全球范围内广泛使用的是注射用Vi多糖疫苗和口服的Ty21a活疫苗。由于多糖疫苗属于非T细胞依赖性抗原,免疫后不形成免疫记忆,产生的抗体主要是亲和力较低的Ig M和Ig G2,且不能在婴幼儿体内产生有效的免疫力,而将细菌的聚糖与适当的蛋白载体结合形成糖蛋白疫苗,属于T细胞依赖性抗原,能够产生更好、更长久的免疫保护效果。细菌中存在糖基化修饰、细菌蛋白糖基化过程与脂多糖的合成的相似性以及pgl基因簇具有糖基化底物蛋白功能的发现,使得O抗原与免疫蛋白载体在细菌体内结合成为了可能。本文采用改进的λ-Red重组系统,成功构建了伤寒菌50096 waa L基因缺失株,同时利用低拷贝质粒成功构建了waa L回复株。对这野生株和新构建的缺失株、回复株进行脂多糖(LPS)银染实验,鉴定3株菌LPS表型,实验结果表明缺失waa L基因导致LPS无法正常合成,在检测凝胶中未形成长串的梯状条带。接着,对所构建的菌株进行生理生化特征研究,结果表明waa L的缺失对菌的生长几乎没有影响。随后,向缺失株中导入含脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)蛋白糖基化途径中糖基转移酶的表达载体,以及改构的重组铜绿假单胞菌(Pseudomonas Aeruginosa)外毒素A(r EPAN29)的表达载体,使重组菌细胞内能够诱导合成以伤寒OPS为目标抗原、以r EPAN29为载体蛋白的伤寒OPS-r EPAN29糖蛋白复合物。随后对其进行了IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳以及双向电泳检验。检测结果显示,重组菌能表达伤寒OPS-r EPAN29糖蛋白复合物,且其蛋白表达谱仅存在较小差异。最后对糖蛋白复合物进行了分离纯化与免疫原性评价,ELISA测定血清抗体滴度表明,r EPAN29做为载体蛋白能有效增加糖链的免疫原性,糖蛋白比单独的多糖能诱导产生更好的免疫应答。该方法成功制备了伤寒O多糖结合疫苗,为糖蛋白疫苗的生产提供了新思路,理论上也适用于其他革兰氏阴性菌的疫苗研发。
【关键词】：结合疫苗 伤寒沙门氏菌 合成生物学 重组EPA O-多糖抗原
【学位授予单位】：吉首大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R392
【目录】：

• 摘要9-10
• ABSTRACT10-12
• 第1章 前言12-16
• 1.1 伤寒沙门氏菌的致病与传播12-13
• 1.2 伤寒的防治策略13-14
• 1.3 多糖疫苗14
• 1.4 糖蛋白疫苗14-15
• 1.5 选题目的与意义15-16
• 第2章 伤寒O-连接糖基化修饰途径的构建与IPTG诱导表达及检测16-28
• 2.1 研究背景16
• 2.2 材料与方法16-23
• 2.2.1 菌株与质粒16-17
• 2.2.2 主要试剂和耗材17
• 2.2.3 主要仪器与分析软件17-18
• 2.2.4 培养基及相关溶液的配制18
• 2.2.5 waaL基因缺失突变株的构建18-21
• 2.2.6 waaL回复突变株的构建21
• 2.2.7 缺失突变株和回复突变株在分子水平上的验证21
• 2.2.8 缺失突变株和回复突变株在表型上的验证21-22
• 2.2.9 野生株、缺失株和回复株在生长状态上的测定22
• 2.2.10 野生株、缺失株和回复株在生化试验上的比较22
• 2.2.11 重组菌株的构建与检验22
• 2.2.12 PglL与rEPAN29的诱导表达与检测22-23
• 2.2.13 蛋白免疫印迹（Western Blot）23
• 2.3 结果23-27
• 2.3.1 缺失株和回复株在分子水平上的验证23-24
• 2.3.2 缺失株和回复株在表型上的验证24
• 2.3.3 野生株、缺失株和回复株在生长状态上的测定24
• 2.3.4 野生株、缺失株和回复株在生化试验上的比较24-26
• 2.3.5 PCR验证重组菌26
• 2.3.6 PglL与rEPAN29在 50096△waaL中的诱导表达26-27
• 2.4 讨论27-28
• 第3章 重组菌的双向电泳检测28-35
• 3.1 研究背景28
• 3.2 材料与方法28-31
• 3.2.1 菌株与质粒28-29
• 3.2.2 主要试剂和耗材29
• 3.2.3 主要仪器与分析软件29
• 3.2.4 培养基及相关溶液的配制29-30
• 3.2.5 全菌蛋白样品的制备30
• 3.2.6 双向电泳样品的纯化与上样前处理30
• 3.2.7 双向电泳：等电聚焦30-31
• 3.2.8 双向电泳：SDS-PAGE31
• 3.2.9 蛋白点分析、胶内酶切与质谱分析31
• 3.3 结果31-33
• 3.3.1 重组菌的双向电泳的图谱比较31-32
• 3.3.2 差异蛋白质谱结果鉴定32-33
• 3.4 讨论33-35
• 第4章 伤寒O-多糖蛋白复合物的分离与纯化35-39
• 4.1 研究背景35
• 4.2 材料与方法35-37
• 4.2.1 菌株35
• 4.2.2 主要试剂与耗材35-36
• 4.2.3 主要仪器与分析软件36
• 4.2.4 培养基及相关溶液的配制36
• 4.2.5 IPTG诱导与菌液的预处理36
• 4.2.6 Chelating亲和层析柱的初步纯化36-37
• 4.2.7 初步纯化样品的除盐37
• 4.2.8 SDS-PAGE检测初步纯化后的糖蛋白样品37
• 4.2.9 ProteinPak DEAE8HR阴离子交换层析柱进一步纯化37
• 4.2.10 Superdex 75层析柱的凝胶过滤精细纯化37
• 4.2.11 SDS-PAGE检测精细纯化后糖蛋白样品37
• 4.3 结果37-38
• 4.3.1 初步纯化后糖蛋白样品的检测37-38
• 4.3.2 精细纯化后糖蛋白样品的检测38
• 4.4 讨论38-39
• 第5章 糖蛋白纯化产物的免疫原性评价39-45
• 5.1 研究背景39
• 5.2 材料与方法39-43
• 5.2.1 菌株与试验动物39
• 5.2.2 主要试剂与耗材39-40
• 5.2.3 主要仪器与分析软件40
• 5.2.4 培养基及相关溶液的配制40
• 5.2.5 伤寒菌脂多糖（LPS）的提取与检测40-41
• 5.2.6 伤寒菌O-多糖（OPS）的制备与检测41
• 5.2.7 LPS、OPS以及纯化后糖蛋白的糖定量41
• 5.2.8 免疫样品的制备41
• 5.2.9 小鼠的免疫试验41-42
• 5.2.10 小鼠血清的采集42
• 5.2.11 间接ELISA法检测血清中抗体滴度42-43
• 5.3 结果43-44
• 5.3.1 伤寒菌LPS、OPS的银染检测43
• 5.3.2 LPS、OPS以及纯化后糖蛋白的糖定量43
• 5.3.3 ELISA检测血清中抗体滴度43-44
• 5.4 讨论44-45
• 第6章 结论与展望45-47
• 致谢47-48
• 参考文献48-51
• 作者在学期间取得的学术成果51-52
• 附录A 核酸试剂盒操作步骤52-56
• 附录B 蛋白试剂盒操作步骤56

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