Lrtm1基因在成肌分化过程中的功能探索
发布时间：2021-01-13 07:03
目的:观察成肌分化过程中C2C12细胞Lrtm1表达;构建小鼠Lrtm1慢病毒过表达载体;筛选稳定表达外源Lrtm1细胞株诱导其分化后观察对成肌分化标志基因Myogenin、Myosin的影响;发现Lrtm1蛋白质表达水平受调控的机制。方法:诱导C2C12细胞分化用Hoechst染色细胞核;将小鼠Lrtm1基因连接到慢病毒载体质粒pLJM1-GFP上并进行慢病毒包装;筛选稳定过表达Lrtm1基因的C2C12细胞系,诱导分化Lrtm1-DDK组、GFP组检测对成肌分化标志基因Myogenin、Myosin表达的影响;MG132处理C2C12-Lrtm1-DDK细胞系后,观察内源性Lrtm1蛋白质表达。结果:诱导分化过程中,肌管形成,Lrmt1、Myosin mRNA水平随分化的进行表达上升;成功构建重组pLJM1-Lrtm1-DDK表达载体;成功筛选稳定表达外源Lrtm1细胞株;诱导稳定细胞系分化后,real-time PCR在144 h时显示Lrtm1-DDK组（272.1±18.22）Myogenin mRNA水平较GFP组（332.41±41.21）减少（P<0.05）;Lr...
【文章来源】：重庆医科大学学报. 2018,43(10)北大核心
【文章页数】：7 页
【部分图文】：
kb1kb1234567891011B.pLJM1-GFP载体酶切电泳
s；55℃20s；60℃5s；40个循环。重复3次实验，使用2-△△Ct计算相对mRNA含量，△Ct=Ct（目的基因）-Ct（内参基因GAPDH），△△Ct=△Ct（实验组）-△Ct（对照组），2-△△Ct表示实验组目的基因mRNA含量相对对照组改变的倍数。各基因引物序列见表1。1.2.3重组质粒的构建为进一步研究Lrtm1基因在成肌分化过程中的作用，本研究决定构建稳定过表达Lrtm1的细胞株。将目的基因Lrtm1进行扩增，用琼脂糖凝胶电泳分析扩增产物，电泳结果显示，PCR扩增产物的长度为1164bp，与理论计算长度相同（图1A）。pLJM1-GFP载体用AgeⅠ、EcoRⅠ内切酶（37℃，60min）酶切进行琼脂糖凝胶电泳，结果显示pLJM1载体双酶切后出现的各个片段与理论计算的条带相符（图1B）。连接转化后挑选8个单克隆菌落进行菌液PCR，实验结果表明1~6号，8号克隆成功连接Lrtm1基因（图1C）。表1各基因引物序列基因引物序列序列长度（bp）Lrtm1DDKMyogeninMyosinGAPDHF：5-TGTTGAATGAGGGTTTGTGCT-3R：5-TCCACGGAGTTTGATGATGG-3F：5-TGAGAAGATGGGAAGTAAGG-3R：5-CTTGTCGTCATCGTCTTTGTAGT-3F：5-CTGACCCTACAGACGCCCAC-3R：5-TGTCCACGATGGACGTAAGG-3F：5-CCAAGGGCCTGAATGAGGAG-3R：5-GCAAAGGCTCCAGGTCTGAG-3F：5-TGGCCTCCAAGGAGTAAGAAAC-3R：5-AGTTGGGATAGGGCCTCTCTTG-31391421621531501：Marker；2：阴性对照；3：PCR产物A.Lrtm1基因PCR产物电泳鉴定B.pLJM1-GFP载体酶切电泳图1：Marker；2：阳性对照；3：阴性对照；4~11：单克隆菌落C.阳性克隆PCR鉴定图1重组质粒的构建4kb3kb2kb1kb1233kb2kb1kbAgeⅠEcoRⅠ--+++-+-3kb2kb1kb1234567891011—1293—
重庆医科大学学报2018年第43卷第10期（JournalofChongqingMedicalUniversity2018.Vol.43No.10）图3重组质粒pLJM1-Lrtm1-DDK在293T细胞中的表达P=0.000）。诱导分化上述2株稳定细胞株0、96、120、144h后，收取细胞检测Lrtm1mRNA表达水平（图4C）。以GFP组为对照，对应时间点Lrtm1-DDK组的Lrtm1mRNA水平分别为GFP组的（72.3±10.76）×102、（79.23±12.33）×102、（127.41±8.75）×102、（140±12.1）×102倍。方差分析Lrtm1mRNA表达水平具有统计学意义（F=93.450，P=0.000）。Lrtm1-DDK组间两两比较，96h组较0h组增加（tD=9.792，P=0.000），120h组较96h组增加（tD=15.750，P=0.000），144h组较120h组增加（tD=17.300，P=0.000）。结果显示：Lrtm1-DDK组随诱导分化时间延长Lrtm1mRNA水平在0h过表达的水平上继续升高。2.3.2qRT-PCR检测Myogenin、MyosinmRNA水平表达诱导分化上述2株稳定细胞株0、96、120、144h后，收取细胞检测Myogenin、MyosinmRNA表达水平。结果如图5A、B所示，检测MyogeninmRNA表达水平，在144h时Lrtm1-DDK组（272.1±18.22）较GFP组（332.41±41.21）减少（P＜0.05），MyosinmRNA水平在分化144h时Lrtm1-DDK组（76.11±10.47）较GFP组（145.51±10.02）明显减少（P＜0.05）。a：与0h组比较P=0.000；b：与48h组比较P=0.000；c：与72h组比较P=0.000A.qRT-PCR检测MyosinmRNA水平表达h48h72h96h0a：与0h组比较P=0.000；b：与0h组比较P=0.000；c：与0h组比较P=0.000B.qRT-PCR检测Lrtm1mRNA水平表达图2诱导C2C12成肌细胞分化在检测Lrtm1、MyosinmRNA水平表达0487296（h）acaba100101MyosinmRAN相对表达量0487296（h）110100Lrtm1mRAN相对表达量aabacLr
本文编号：2974436
【文章来源】：重庆医科大学学报. 2018,43(10)北大核心
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kb1kb1234567891011B.pLJM1-GFP载体酶切电泳
s；55℃20s；60℃5s；40个循环。重复3次实验，使用2-△△Ct计算相对mRNA含量，△Ct=Ct（目的基因）-Ct（内参基因GAPDH），△△Ct=△Ct（实验组）-△Ct（对照组），2-△△Ct表示实验组目的基因mRNA含量相对对照组改变的倍数。各基因引物序列见表1。1.2.3重组质粒的构建为进一步研究Lrtm1基因在成肌分化过程中的作用，本研究决定构建稳定过表达Lrtm1的细胞株。将目的基因Lrtm1进行扩增，用琼脂糖凝胶电泳分析扩增产物，电泳结果显示，PCR扩增产物的长度为1164bp，与理论计算长度相同（图1A）。pLJM1-GFP载体用AgeⅠ、EcoRⅠ内切酶（37℃，60min）酶切进行琼脂糖凝胶电泳，结果显示pLJM1载体双酶切后出现的各个片段与理论计算的条带相符（图1B）。连接转化后挑选8个单克隆菌落进行菌液PCR，实验结果表明1~6号，8号克隆成功连接Lrtm1基因（图1C）。表1各基因引物序列基因引物序列序列长度（bp）Lrtm1DDKMyogeninMyosinGAPDHF：5-TGTTGAATGAGGGTTTGTGCT-3R：5-TCCACGGAGTTTGATGATGG-3F：5-TGAGAAGATGGGAAGTAAGG-3R：5-CTTGTCGTCATCGTCTTTGTAGT-3F：5-CTGACCCTACAGACGCCCAC-3R：5-TGTCCACGATGGACGTAAGG-3F：5-CCAAGGGCCTGAATGAGGAG-3R：5-GCAAAGGCTCCAGGTCTGAG-3F：5-TGGCCTCCAAGGAGTAAGAAAC-3R：5-AGTTGGGATAGGGCCTCTCTTG-31391421621531501：Marker；2：阴性对照；3：PCR产物A.Lrtm1基因PCR产物电泳鉴定B.pLJM1-GFP载体酶切电泳图1：Marker；2：阳性对照；3：阴性对照；4~11：单克隆菌落C.阳性克隆PCR鉴定图1重组质粒的构建4kb3kb2kb1kb1233kb2kb1kbAgeⅠEcoRⅠ--+++-+-3kb2kb1kb1234567891011—1293—
重庆医科大学学报2018年第43卷第10期（JournalofChongqingMedicalUniversity2018.Vol.43No.10）图3重组质粒pLJM1-Lrtm1-DDK在293T细胞中的表达P=0.000）。诱导分化上述2株稳定细胞株0、96、120、144h后，收取细胞检测Lrtm1mRNA表达水平（图4C）。以GFP组为对照，对应时间点Lrtm1-DDK组的Lrtm1mRNA水平分别为GFP组的（72.3±10.76）×102、（79.23±12.33）×102、（127.41±8.75）×102、（140±12.1）×102倍。方差分析Lrtm1mRNA表达水平具有统计学意义（F=93.450，P=0.000）。Lrtm1-DDK组间两两比较，96h组较0h组增加（tD=9.792，P=0.000），120h组较96h组增加（tD=15.750，P=0.000），144h组较120h组增加（tD=17.300，P=0.000）。结果显示：Lrtm1-DDK组随诱导分化时间延长Lrtm1mRNA水平在0h过表达的水平上继续升高。2.3.2qRT-PCR检测Myogenin、MyosinmRNA水平表达诱导分化上述2株稳定细胞株0、96、120、144h后，收取细胞检测Myogenin、MyosinmRNA表达水平。结果如图5A、B所示，检测MyogeninmRNA表达水平，在144h时Lrtm1-DDK组（272.1±18.22）较GFP组（332.41±41.21）减少（P＜0.05），MyosinmRNA水平在分化144h时Lrtm1-DDK组（76.11±10.47）较GFP组（145.51±10.02）明显减少（P＜0.05）。a：与0h组比较P=0.000；b：与48h组比较P=0.000；c：与72h组比较P=0.000A.qRT-PCR检测MyosinmRNA水平表达h48h72h96h0a：与0h组比较P=0.000；b：与0h组比较P=0.000；c：与0h组比较P=0.000B.qRT-PCR检测Lrtm1mRNA水平表达图2诱导C2C12成肌细胞分化在检测Lrtm1、MyosinmRNA水平表达0487296（h）acaba100101MyosinmRAN相对表达量0487296（h）110100Lrtm1mRAN相对表达量aabacLr
本文编号：2974436
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