多重巢式固相PCR-Array芯片用于高致病性病原微生物并行检测
发布时间：2021-01-18 08:47
提出了一种多重巢式固相PCR的方法,以微流控芯片为载体,采用紫外交联方式将寡核苷酸序列固定在芯片上,构建了阵列式固相PCR-阵列（PCR-Array）芯片,用于细菌和病毒类高致病性病原微生物的并行检测。选择新疆出血热病毒、埃博拉病毒、炭疽杆菌和布鲁氏菌4种代表性高致病性病原微生物为研究对象,通过基因工程手段构建了包含有炭疽杆菌和布鲁氏菌特异性基因片段的重组质粒载体,利用病毒包装技术构建了包含有两种病毒特异性基因片段的逆转录病毒颗粒,完成了4种高致病性病原微生物阳性标准品的制备,并以此作为实验样本,探究了多重巢式固相PCR-Array芯片的制备方法和扩增体系。结果表明,在优化的实验条件下,多重巢式固相PCR-Array芯片检测4种高致病性病原微生物的检出限达10 copy/μL以下量级。本方法灵敏度高,特异性好,同时,引物空间上的隔离避免了相互干扰,提高了检测通量,在多种病原微生物快速并行检测方面具有良好的应用前景。
【文章来源】：分析化学. 2019,47(11)北大核心
【文章页数】：8 页
【部分图文】：
多重巢式固相PCＲ-Array芯片检测原理图:(A)多重巢式固相PCＲ体系组成:细菌DNA、病毒ＲNA、游离上下游引物、固相引物;(B)多重巢式固相PCＲ扩增第一阶段，游离上下游引物优先与模板
图2(A)100μmol/L引物浓度，不同紫外交联时间下，经固相ＲT-PCＲ扩增后，产物荧光强度的变化;(B)引物浓度为50μmol/L和100μmol/L时，紫外交联时间与扩增产物荧光强度间关系Fig．2(A)ChangeoffluorescenceintensityofthesolidＲT-PCＲproductwiththetimeofultravioletcross-linkingat100μmol/Lsolidprimer;(B)Fluorescenceintensityoftheamplifiedproductsversustimeofultravioletcross-linkingat50μmol/Land100μmol/Lsolidprimers相PCＲ方法中，液相引物以一定比例存在于PCＲ反应体系中;若液相上下游引物比值过高，说明上游引物过多，而带有荧光标记的下游引物较少，在巢式固相PCＲ的第二阶段中，上游引物会竞争抑制固相引物与模板的结合，因此影响第二阶段的扩增效率;若液相上下游引物比值过低，则直接影响第一阶段液相PCＲ扩增效率，使得第一阶段扩增产物量较少，影响巢式固相PCＲ终产物数量。另外，由于固相PCＲ是通过检测固定点的荧光信号实现待测目标的判定，因此，固相引物浓度直接影响了巢式固相PCＲ方法的检出限。本研究将浓度为25～150μmol/L的引物固定在芯片表面，以5．62×104copy/μL埃博拉病毒阳性标准品的ＲNA为模板，在游离液相上下游引物浓度比值分别是1∶4和1∶2条件下，经巢式固相ＲT-PCＲ扩增后，比较不同引物浓度组合下，芯片上固定产物的荧光强度。如图3A所示，当液相上下游引物浓度比值为1∶4时，随着固相引物浓度的持续升高时，经固相ＲT-PCＲ扩增后，荧光强度持续增强，在固相引物浓度为100μmol/L时达到最大值;但随着引物浓度持续增加(100～150μmol/L)，荧光强度呈下降趋势，这表明持续增加固相引物浓度不能提高固相ＲT-PCＲ扩增效率及扩增产物数量。因此，本研究确定固相引物最适浓度为100μmol/L。图3(A)游离引物?
蔚睦┰鲂??若液相上下游引物比值过低，则直接影响第一阶段液相PCＲ扩增效率，使得第一阶段扩增产物量较少，影响巢式固相PCＲ终产物数量。另外，由于固相PCＲ是通过检测固定点的荧光信号实现待测目标的判定，因此，固相引物浓度直接影响了巢式固相PCＲ方法的检出限。本研究将浓度为25～150μmol/L的引物固定在芯片表面，以5．62×104copy/μL埃博拉病毒阳性标准品的ＲNA为模板，在游离液相上下游引物浓度比值分别是1∶4和1∶2条件下，经巢式固相ＲT-PCＲ扩增后，比较不同引物浓度组合下，芯片上固定产物的荧光强度。如图3A所示，当液相上下游引物浓度比值为1∶4时，随着固相引物浓度的持续升高时，经固相ＲT-PCＲ扩增后，荧光强度持续增强，在固相引物浓度为100μmol/L时达到最大值;但随着引物浓度持续增加(100～150μmol/L)，荧光强度呈下降趋势，这表明持续增加固相引物浓度不能提高固相ＲT-PCＲ扩增效率及扩增产物数量。因此，本研究确定固相引物最适浓度为100μmol/L。图3(A)游离引物浓度比值F∶Ｒ=1∶4时，不同固定引物浓度，经巢式固相ＲT-PCＲ扩增后的产物荧光强度变化;(B)游离引物F∶Ｒ分别是1∶4和1∶2时，固定引物浓度与扩增产物荧光强度间关系Fig．3(A)Withconcentrationratioofliquidprimerof1∶4，fluorescenceintensityofsolidＲT-PCＲproductatdifferentconcentrationsofsolidsupportprimer;(B)EffectofconcentrationofsolidprimerandliquidprimeronSP-PCＲ同时，在游离液相上下游引物浓度比值分别是1∶4和1∶2条件下(图3B)，当固相引物浓度较低时(＜100μmol/L)，液相上下游引物浓度比值为1∶2的反应体系扩增效率更高，固定点荧光强度较高;但第11期朱灿灿等:多重巢式固相PCＲ-Array芯片用于高致病性病原微生物并行检测5571
【参考文献】：
期刊论文
[1]TaqMan-LNA探针多重实时荧光定量PCR检测炭疽芽胞杆菌的研究[J]. 刘东立,李文涓,石一,张铮,马国柱,张恩民,李伟. 中国病原生物学杂志. 2018(03)
[2]布鲁氏菌病与炭疽病多重PCR方法的建立[J]. 豆玲,贺奋义,周峰,豆思远,张登基,郭慧琳. 畜牧兽医杂志. 2017(02)
[3]微流控芯片分析化学实验室[J]. 林炳承,秦建华. 高等学校化学学报. 2009(03)
[4]微流控芯片实验室及其功能化[J]. 林炳承. 中国药科大学学报. 2003(01)
本文编号：2984648
【文章来源】：分析化学. 2019,47(11)北大核心
【文章页数】：8 页
【部分图文】：
多重巢式固相PCＲ-Array芯片检测原理图:(A)多重巢式固相PCＲ体系组成:细菌DNA、病毒ＲNA、游离上下游引物、固相引物;(B)多重巢式固相PCＲ扩增第一阶段，游离上下游引物优先与模板
图2(A)100μmol/L引物浓度，不同紫外交联时间下，经固相ＲT-PCＲ扩增后，产物荧光强度的变化;(B)引物浓度为50μmol/L和100μmol/L时，紫外交联时间与扩增产物荧光强度间关系Fig．2(A)ChangeoffluorescenceintensityofthesolidＲT-PCＲproductwiththetimeofultravioletcross-linkingat100μmol/Lsolidprimer;(B)Fluorescenceintensityoftheamplifiedproductsversustimeofultravioletcross-linkingat50μmol/Land100μmol/Lsolidprimers相PCＲ方法中，液相引物以一定比例存在于PCＲ反应体系中;若液相上下游引物比值过高，说明上游引物过多，而带有荧光标记的下游引物较少，在巢式固相PCＲ的第二阶段中，上游引物会竞争抑制固相引物与模板的结合，因此影响第二阶段的扩增效率;若液相上下游引物比值过低，则直接影响第一阶段液相PCＲ扩增效率，使得第一阶段扩增产物量较少，影响巢式固相PCＲ终产物数量。另外，由于固相PCＲ是通过检测固定点的荧光信号实现待测目标的判定，因此，固相引物浓度直接影响了巢式固相PCＲ方法的检出限。本研究将浓度为25～150μmol/L的引物固定在芯片表面，以5．62×104copy/μL埃博拉病毒阳性标准品的ＲNA为模板，在游离液相上下游引物浓度比值分别是1∶4和1∶2条件下，经巢式固相ＲT-PCＲ扩增后，比较不同引物浓度组合下，芯片上固定产物的荧光强度。如图3A所示，当液相上下游引物浓度比值为1∶4时，随着固相引物浓度的持续升高时，经固相ＲT-PCＲ扩增后，荧光强度持续增强，在固相引物浓度为100μmol/L时达到最大值;但随着引物浓度持续增加(100～150μmol/L)，荧光强度呈下降趋势，这表明持续增加固相引物浓度不能提高固相ＲT-PCＲ扩增效率及扩增产物数量。因此，本研究确定固相引物最适浓度为100μmol/L。图3(A)游离引物?
蔚睦┰鲂??若液相上下游引物比值过低，则直接影响第一阶段液相PCＲ扩增效率，使得第一阶段扩增产物量较少，影响巢式固相PCＲ终产物数量。另外，由于固相PCＲ是通过检测固定点的荧光信号实现待测目标的判定，因此，固相引物浓度直接影响了巢式固相PCＲ方法的检出限。本研究将浓度为25～150μmol/L的引物固定在芯片表面，以5．62×104copy/μL埃博拉病毒阳性标准品的ＲNA为模板，在游离液相上下游引物浓度比值分别是1∶4和1∶2条件下，经巢式固相ＲT-PCＲ扩增后，比较不同引物浓度组合下，芯片上固定产物的荧光强度。如图3A所示，当液相上下游引物浓度比值为1∶4时，随着固相引物浓度的持续升高时，经固相ＲT-PCＲ扩增后，荧光强度持续增强，在固相引物浓度为100μmol/L时达到最大值;但随着引物浓度持续增加(100～150μmol/L)，荧光强度呈下降趋势，这表明持续增加固相引物浓度不能提高固相ＲT-PCＲ扩增效率及扩增产物数量。因此，本研究确定固相引物最适浓度为100μmol/L。图3(A)游离引物浓度比值F∶Ｒ=1∶4时，不同固定引物浓度，经巢式固相ＲT-PCＲ扩增后的产物荧光强度变化;(B)游离引物F∶Ｒ分别是1∶4和1∶2时，固定引物浓度与扩增产物荧光强度间关系Fig．3(A)Withconcentrationratioofliquidprimerof1∶4，fluorescenceintensityofsolidＲT-PCＲproductatdifferentconcentrationsofsolidsupportprimer;(B)EffectofconcentrationofsolidprimerandliquidprimeronSP-PCＲ同时，在游离液相上下游引物浓度比值分别是1∶4和1∶2条件下(图3B)，当固相引物浓度较低时(＜100μmol/L)，液相上下游引物浓度比值为1∶2的反应体系扩增效率更高，固定点荧光强度较高;但第11期朱灿灿等:多重巢式固相PCＲ-Array芯片用于高致病性病原微生物并行检测5571
【参考文献】：
期刊论文
[1]TaqMan-LNA探针多重实时荧光定量PCR检测炭疽芽胞杆菌的研究[J]. 刘东立,李文涓,石一,张铮,马国柱,张恩民,李伟. 中国病原生物学杂志. 2018(03)
[2]布鲁氏菌病与炭疽病多重PCR方法的建立[J]. 豆玲,贺奋义,周峰,豆思远,张登基,郭慧琳. 畜牧兽医杂志. 2017(02)
[3]微流控芯片分析化学实验室[J]. 林炳承,秦建华. 高等学校化学学报. 2009(03)
[4]微流控芯片实验室及其功能化[J]. 林炳承. 中国药科大学学报. 2003(01)
本文编号：2984648
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