结核分枝杆菌双组分调控系统KdpD/E基因缺失株的构建及功能的初步研究

发布时间：2021-01-29 09:57

　　结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）是导致人类结核病（tuberculosis,TB）的病原菌,全世界大约有三分之一的人口潜伏感染结核分枝杆菌。有研究表明,双组分调控系统KdpD/E在结核分枝杆菌感染巨噬细胞的过程中发挥重要作用,并参与细菌毒力的调节,但具体的作用机制目前尚不清楚。本研究在结核分枝杆菌中缺失了双组分调控系统KdpD/E,并对该系统在入侵巨噬细胞、胞内存活以及毒力调节过程中的作用进行了研究。1.双组分调控系统KdpD/E基因缺失株的构建与鉴定构建目的基因等位交换底物并克隆到含有温敏型分枝杆菌噬菌体元件的穿梭载体phAE159上,等位交换底物经噬菌体高效传递到待敲除菌株中。利用潮霉素抗性筛选阳性克隆子并通过PCR进行鉴定,结果表明结核分枝杆菌双组分调控系统KdpD/E基因缺失株ΔkdpD、ΔkdpE、ΔkdpDE构建成功。2.基因缺失株与野生株生物学特性的比较本研究通过测定缺失株与野生株OD600以及CFU与时间的对应关系曲线,发现双组分调控系统KdpD/E的缺失对菌株的生长未造成明显的影响。实验还比较了基因缺失株和野生株在固体培养基上的菌落... 

【文章来源】：华中农业大学湖北省 211工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：65 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
缩略语表（Abbreviation）
1 文献综述
    1.1 结核分枝杆菌概述
        1.1.1 结核分枝杆菌病原学
        1.1.2 结核分枝杆菌流行病学
    1.2 结核分枝杆菌双组分调控系统
        1.2.1 结核分枝杆菌双组分调控系统概述
        1.2.2 结核分枝杆菌双组分调控系统KdpD/E研究进展
2 研究目的与意义
3 材料与方法
    3.1 实验材料
        3.1.1 菌株、质粒载体和细胞
        3.1.2 主要试剂及试剂盒
        3.1.3 培养基及抗生素的配制
        3.1.4 主要溶液的配制
        3.1.5 引物
    3.2 实验方法
        3.2.1 结核分枝杆菌基因组DNA的提取
        3.2.2 同源重组载体的构建
        3.2.3 高滴度噬菌体裂解液的制备
        3.2.4 噬菌体感染待敲除菌株以及基因缺失株的鉴定
        3.2.5 基因缺失株生长特性的研究
        3.2.6 THP-1 细胞入侵实验和胞内存活实验
        3.2.7 KdpE蛋白的原核表达及纯化
        3.2.8 兔抗KdpE蛋白多克隆抗体的制备
        3.2.9 结核分枝杆菌总RNA的提取
        3.2.10 荧光定量PCR
4 结果与分析
    4.1 同源重组载体的构建
        4.1.1 pYUB1471重组质粒的构建
        4.1.2 phAE159重组质粒的构建
    4.2 基因缺失株的鉴定
    4.3 基因缺失株生长特性的研究
        4.3.1 生长曲线的绘制
        4.3.2 菌落形态的比较
    4.4 THP-1 细胞入侵实验和胞内存活实验
    4.5 KdpE蛋白的原核表达及纯化
        4.5.1 pET-28a-kdp E重组质粒的构建
        4.5.2 KdpE蛋白的诱导表达及纯化
    4.6 兔抗KdpE蛋白多克隆抗体的制备
    4.7 结核分枝杆菌总RNA的提取
    4.8 荧光定量PCR检测差异表达基因
5 讨论
    5.1 结核分枝杆菌基因缺失方法的探讨
    5.2 KdpD/E的缺失对结核分枝杆菌生长特性的影响
    5.3 KdpD/E的缺失对结核分枝杆菌在感染巨噬细胞过程中的影响
    5.4 反应调节蛋白KdpE的表达和多克隆抗体的制备
    5.5 KdpD/E的缺失对结核分枝杆菌重要功能基因的影响
6 结论
参考文献
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]不同破壁方法提取结核分枝杆菌总RNA的比较[J]. 罗影殊,黄偌颖,刘衡川,高文凤.  中国防痨杂志. 2013(03)
[2]结核分枝杆菌总RNA提取方法的比较研究[J]. 贾红彦,李自慧,杜博平,邢爱英,孙琦,张宗德.  临床肺科杂志. 2012(07)
[3]粪肠球菌总RNA提取方法的比较研究[J]. 邹彬彬,漆涌,伍勇.  湖南师范大学学报(医学版). 2009(02)



本文编号：3006692