Notch信号抑制剂和TLR配体联合作为佐剂对呼吸道合胞病毒疫苗增强性免疫病理的调节作用

发布时间：2017-04-12 09:07

  本文关键词：Notch信号抑制剂和TLR配体联合作为佐剂对呼吸道合胞病毒疫苗增强性免疫病理的调节作用，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的:呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus,RSV)是一种副粘病毒科的单股负链RNA病毒,属于肺炎病毒属,是引起婴幼儿下呼吸道感染最重要的病原体之一,严重危害了婴幼儿的身体健康,在全球范围内,每年大概约有数百万儿童感染RSV病毒,其中50%以上为小于1岁的婴儿,患儿可反复多次感染,严重者可以导致死亡;另外,RSV也是造成老年人群和免疫缺陷者高患病率和死亡率的重要原因。但是,目前尚无成功有效的疫苗,在二十世纪六十年代曾研制过福尔马林灭活疫苗(FI-RSV),可惜接种幼儿后导致了严重的肺部疫苗增强性疾病,而且导致两例死亡。现在,世界卫生组织已把呼吸道合胞病毒(RSV)疫苗确定为优先发展的疫苗之一。Notch信号是一种信号传导途径,具高度保守性,其通过与相邻细胞间的互相作用来调节各个组织和细胞的分化及发育,是一条重要的,影响细胞命运的信号转导通路。它几乎可以涉及调节所有细胞的分化、增殖和凋亡活动,因为其调节细胞的分化、增殖和凋亡,所以对一系列生理和病理过程都有影响。在固有免疫以及适应性免疫细胞的活化、增殖及分化过程中发挥着重要作用。在哺乳动物中,Notch信号已鉴定出4个Notch受体(Notch1-4)和5个配体(Delta1、3、4及Jagged1、2)。Notch信号可能会通过影响疫苗刺激的APC及淋巴细胞的活性来调节RSV疫苗增强性肺部免疫病理。Cp G是TLR-9的配体,通过激活NF-κB而激活各种免疫细胞,具有广泛的免疫调节作用,特别是Cp G促进DCs产生IFN-γ等细胞因子,促进Th1应答,增强CTL活性等。所以,本研究以TLR-9的配体Cp G2216和Notch信号抑制剂作为疫苗FI-RSV的佐剂,通过抑制小鼠的Notch信号,来研究Notch信号和Cp G在RSV疫苗增强性肺部免疫病理中的作用。方法：1培养Hep-2细胞,在Hep-2细胞上培养RSV,测定RSV滴度。2制备福尔马林灭活疫苗(FI-RSV)、福尔马林灭活加Al(OH)3疫苗(FI-RSV+Al(OH)3)和对照组疫苗(FI-control)。3动物实验3.1小鼠免疫将54只6-9周龄雌性C57Bl/6小鼠随机分为9组,每组6只,分别为①Control组,不作任何处理;②FI-control组;③FI-RSV组;⑤FI-RSV+Al(OH)3;④FI-RSV+Cp G组;⑥FI-control+DMSO组;⑦FI-RSV+L-685,458;⑧FI-RSV+Al(OH)3+L-685,458组;⑨FI-RSV+Cp G+L-685,458组,肌肉注射免疫,共免疫2次,每次间隔4周。3.2体液免疫检测末次免疫后10天小鼠内眦取血,分离血清,用空斑抑制实验检测血清中和抗体水平,并用ELISA检测特异性抗体Ig G、Ig G1和Ig G2a水平。3.3末次免疫4周后用100μl106pfu/ml的RSV攻击被免疫小鼠(鼻腔),每天监测被感染小鼠的体重,观察是否有体重变化。3.4 5天后处死已攻毒的小鼠,提取组织并做相关检测。3.5做肺组织病理切片,HE染色,观察炎症浸润情况;PAS(periodic acid Schiff)染色,观察气道粘液分泌情况;实时定量PCR测定肺组织中细胞因子和RSV-N基因的表达情况;支气管肺泡灌洗液细胞涂片,观察炎性细胞变化情况;检测肺组织内的病毒滴度,观察疫苗的保护情况;ELISA检测肺匀浆上清中细胞因子TNF-α、IFN-γ、IL-1β、IL-4、IL-10、IL-6、IL-13、IL-17的表达情况。结果:1成功培养出RSV,并测定病毒滴度107.86pfu/ml。2成功制备福尔马林灭活疫苗(FI-RSV)、福尔马林灭活加Al(OH)3疫苗和对照疫苗(FI-control)。3小鼠血清中特异性抗体Ig G及中和抗体测定结果各免疫组产生特异性Ig G、Ig G1和Ig G2a,抗体水平较Control组差异有统计学意义(P0.05)。各免疫组产生的特异性Ig G、Ig G1和Ig G2a抗体水平与FI-control及FI-control+DMSO组比较差异有统计学意义(P0.05),FI-control与FI-control+DMSO组之间比较无差异。各免疫组诱导的Ig G和Ig G1无显著差异,FI-RSV+Cp G+L-685,458组诱导的Ig G2a显著高于其他各免疫组(P0.05);FI-RSV+Cp G+L-685,458组Ig G1/Ig G2a的比值(1.02)明显低于各免疫组(P0.05),FI-RSV+Al(OH)3+L-685,458的比值(1.44)高于各免疫组,其它各组比较无差异。各免疫组产生的中和抗体水平显著高于FI-control及FI-control+DMSO组(P0.05),FI-control与FI-control+DMSO组之间比较无差异。另外,FI-RSV组显著高于FI-RSV+L-685,458(P0.05),FI-RSV+Al(OH)3组显著高于FI-RSV+Al(OH)3+L-685,458(P0.05),FI-RSV+Cp G与FI-RSV+Cp G+L-685,458组比较差异无统计学意义。4 RSV感染后小鼠的体重变化与Control组相比,FI-RSV+Cp G+L-685,458组在各时间点的体重变化均无显著性差异(P0.05);而其他各免疫组在不同的时间点均有不同程度的下降,其中FI-RSV+Cp G和FI-RSV+L-685,458组在攻击后第二天体重减低达到峰值,且显著低于Control组(P0.05);FI-RSV、FI-RSV+Al(OH)3和FI-RSV+Al(OH)3+L-685,458组分别于攻毒后1、3和5天体重减少达到峰值,分别显著低于Control组(P0.05);另外,与各免疫组相比FI-RSV+Cp G组体重下降最明显,攻毒后1、2、3天均显著低于其它各组(P0.05);FI-RSV+L-685,458与FI-RSV比较各时间点均无统计学意义(P0.05);FI-RSV+Al(OH)3+L-685,458组于1、2天均显著高于FI-RSV+Al(OH)3组;FI-RSV+Al(OH)3与FI-RSV组各时间点均无显著差异;这些结果说明:L-685,458单独与FI-RSV联用对体重减轻无影响,Cp G单独作为佐剂加剧了体重减轻,而Cp G与L-685,458联合作为FI-RSV的佐剂可完全纠正体重减轻;另外,Al(OH)3佐剂不能改善体重减轻,Al(OH)3与L-685,458联合作为FI-RSV的佐剂可部分纠正体重减轻。5肺组织染色5.1 PAS染色的肺组织切片显示与Control组相比FI-control组、FI-RSV组、FI-control+DMSO组、FI-RSV+Al(OH)3、FI-RSV+Al(OH)3+L-685,458 RSV攻击后均呈现出不同程度的粘液分泌,其中FI-RSV+Al(OH)3、FI-RSV+Al(OH)3+L-685,458组呈现大量的粘液分泌,FI-RSV+Cp G、FI-RSV+Cp G+L-685,458组粘液分泌不明显。5.2 HE染色的肺组织切片显示Control组小鼠,肺泡壁结构完整,无水肿,肺泡周围仅有少量白细胞;FI-control、FI-control+DMSO组和FI-RSV组小鼠支气管周围、血管周围和肺泡间质炎性细胞增多,肺泡壁轻微增厚;FI-RSV+Cp G组、FI-RSV+Al(OH)3、FI-RSV+Al(OH)3+L-685,458与FI-RSV+L-685,458组小鼠经RSV攻击后肺部显示炎症细胞浸润,肺泡壁也明显增厚,肺泡间甚至出现融合和水肿,并且偶见出血点,其中多为淋巴细胞,有时可见单核-巨噬细胞、中性粒细胞和嗜酸性性粒细胞等;FI-RSV+Cp G+L-685,458组肺泡间质未见炎症细胞浸润,肺泡壁正常,支气管和血管周围偶见少量炎症细胞。6实时定量检测细胞因子6.1检测肺组织内RSV管家基因RSV-N的表达量FI-control组、FI-control+DMSO组和FI-RSV组肺组织RSV-N基因的表达量显著高于其他免疫组(P0.05);另外,FI-RSV+Cp G+L-685,458组的表达量显著低于FI-RSV+Cp G组和FI-RSV+L-685,458组。6.2.1 IFN-γFI-RSV+Cp G、FI-RSV和FI-RSV+Al(OH)3组的IFN-γ显著高于其它各组(P0.05)。6.2.2 IL-4Control组和FI-RSV+Al(OH)3+L-685,458组的IL-4明显高于其它各组(P0.05),其他各组无显著差异(P0.05)。6.2.3 IL-5IL-5的表达量FI-RSV+Cp G+L-685,458组显著低于FI-RSV+Cp G组和FI-RSV+Al(OH)3组、FI-RSV+Al(OH)3+L-685,458组(P0.05)。6.2.4 IL-10FI-control组、FI-RSV组和FI-RSV+Al(OH)3+L-685,458组IL-10的表达量显著高于其它各组(P0.05);另外,FI-RSV+Cp G+L-685,458组的表达量显著低于FI-RSV+Cp G组(P0.05)。6.2.5 IL-13各免疫组IL-13的表达量显著高于Control组(P0.05);另外,FI-RSV+Cp G+L-685,458组的表达量显著低于FI-RSV+Cp G组、FI-RSV+L-685,458组(P0.05)。6.2.6 IL-1βFI-control组、FI-RSV+Cp G组IL-1β的表达量显著高于其他各组(P0.05);另外,FI-RSV+Cp G+L-685,458组的表达量显著低于FI-RSV组、FI-RSV+L-685,458组(P0.05)。6.2.7 IL-17FI-RSV+Cp G组IL-17的表达量显著高于除FI-control组、FI-RSV组之外的其他各组(p0.05),FI-RSV组显著高于FI-RSV+Al(OH)3+L-685,458组、FI-RSV+L-685,458组、FI-RSV+Cp G+L-685,458组(P0.05)。6.2.8 TNF-αFI-RSV+Al(OH)3+L-685,458组和FI-RSV+Al(OH)3组TNF-α的表达量显著高于其他各组(P0.05);另外,FI-RSV+Cp G+L-685,458组的表达量显著低于FI-RSV组、FI-RSV+Cp G组(P0.05)。6.2.9T-betFI-RSV+Cp G组T-bet的表达量显著高于其他组(P0.05);FI-control+DMSO组的表达量显著高于Control组(P0.05)。6.2.10 ROR-γtFI-RSV+Cp G组ROR-γt显著高于其他各组(P0.05);FI-RSV+Cp G+L-685,458组的表达量显著低于FI-RSV组、FI-RSV+L-685,458组(P0.05)。6.2.11GATA-3FI-RSV+Al(OH)3+L-685,458组和FI-RSV+Al(OH)3组GATA-3的表达量显著高于其他各组(P0.05);FI-RSV+Cp G+L-685,458组的表达量显著低于FI-RSV组、FI-RSV+Cp G组(P0.05)。7支气管肺泡灌洗液细胞涂片7.1各免疫组小鼠支气管肺泡灌洗液中的细胞总数和Control有显著差异(P0.05),FI-RSV+Cp G组高于其他各组(P0.05);FI-RSV+Cp G+L-685,458组低于除FI-control组、FI-RSV组外的其他各组(P0.05)。7.2各免疫组小鼠感染RSV5天后支气管肺泡灌洗液中的巨噬细胞比例和正常对照组有差异显著(P0.05),FI-RSV+Cp G+L-685,458组显著高于除FI-RSV+L-685,458组外的其他各组(P0.05)。7.3各免疫组小鼠感染RSV5天后支气管肺泡灌洗液中的淋巴细胞百分数和正常对照组有差异显著(P0.05),FI-RSV+Cp G+L-685,458组显著低于除FI-RSV+Al(OH)3+L-685,458组、FI-RSV+L-685,458组外的其他各组(P0.05)。7.4各免疫组小鼠感染RSV5天后支气管肺泡灌洗液中的中性粒细胞百分数和正常对照组有差异显著(P0.05),FI-RSV+Cp G+L-685,458组显著低于FI-RSV组、FI-RSV+Cp G组、FI-RSV+Al(OH)3组、FI-RSV+Al(OH)3+L-685,458组(P0.05)。8肺匀浆病毒滴定病毒滴定结果显示:Control组未检测到病毒;其余各免疫组有一定的病毒滴度,但各免疫组的病毒滴度均显著低于FI-control组、FI-control+DMSO组(P0.05);FI-control组与FI-control+DMSO组的病毒滴度无显著差异(P0.05)。9 ELISA检测细胞因子9.1 IFN-γ各免疫组IFN-γ的表达量显著高于Control组(P0.05);FI-RSV+Al(OH)3+L-685,458组、FI-RSV+Al(OH)3组、FI-RSV+Cp G+L-685,458组、FI-RSV+L-685,458组低于FI-control组(P0.05);另外,FI-RSV+Cp G+L-685,458组低于FI-RSV组、FI-RSV+Cp G组(P0.05)。9.2 IL-1βFI-RSV组IL-1β的表达量显著高于其他各组;FI-RSV+Al(OH)3+L-685,458组低于FI-RSV+Cp G+L-685,458组(P0.05);FI-RSV+Cp G+L-685,458组低于FI-RSV+Cp G组(P0.05)。9.3 IL-4各免疫组IL-4的表达量显著高于Control组(P0.05);FI-RSV+Cp G+L-685,458组低于FI-RSV组、FI-RSV+Cp G组(P0.05)。9.4 IL-6除FI-RSV+Al(OH)3+L-685,458组、FI-RSV+Cp G+L-685,458组外,各组IL-6表达量显著高于Control组(P0.05);另外,FI-RSV+Cp G+L-685,458组低于FI-RSV组、FI-RSV+Cp G组(P0.05),FI-RSV+CPG组低于FI-RSV组(P0.05)。9.5 IL-10除FI-RSV+Al(OH)3+L-685,458组、FI-RSV+L-685,458组外,各组IL-10表达量显著高于Control组(P0.05);另外,FI-RSV+Cp G+L-685,458组低于FI-RSV组、FI-RSV+Cp G组(P0.05)。9.6 IL-13除FI-control组、FI-RSV+Al(OH)3组、FI-RSV+Al(OH)3+L-685,458组外,各组IL-13表达量显著高于Control组(P0.05),另外,FI-RSV+Cp G+L-685,458组低于FI-RSV组、FI-RSV+Cp G组(P0.05)。9.7 IL-17FI-RSV组、FI-RSV+Cp G组IL-17表达量显著高于Control组、FI-control组、FI-control+DMSO组、FI-RSV+Al(OH)3+L-685,458组(P0.05);另外,FI-RSV+Cp G+L-685,458组低于FI-RSV组、FI-RSV+Cp G组(P0.05)。9.8TNF-α除FI-RSV+L-685,458组、FI-RSV+Al(OH)3+L-685,458组外其他各组TNF-α的表达量显著高于Control组(P0.05);FI-RSV+L-685,458组低于FI-control组、FI-RSV组、FI-RSV+Cp G组、FI-control+DMSO组(P0.05);另外,FI-RSV+Cp G+L-685,458组低于FI-RSV组、FI-RSV+Cp G组(P0.05)。结论:1 Cp G与L-685,458作为联合佐剂对Ig G抗体和中和抗体的效价无显著影响,但可明显增加Ig G2a的效价,使Ig G1/Ig G2a更平衡。2 Cp G与L-685,458作为联合佐剂对疫苗的保护性无显著影响,即不降低疫苗的保护性。3 Cp G与L-685,458作为联合佐剂可显著减轻肺部免疫病理损伤,FI-RSV+Cp G+L-685,458组小鼠在RSV攻击后未见疫苗增强性疾病,是FI-RSV疫苗的理想佐剂。4 Cp G与L-685,458联合佐剂对疫苗免疫应答的可能调节机制:通过TLR信号和Notch信号的互作,调节Th1、Th2和Th17型应答平衡,从而调节肺部的炎症应答平衡。
【关键词】：Notch信号 CpG 佐剂 呼吸道合胞病毒疫苗 疫苗 疫苗增强型免疫病理
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R392
【目录】：

• 中文摘要4-12
• 英文摘要12-22
• 英文缩写22-23
• 前言23-25
• 材料与方法25-40
• 结果40-46
• 附图46-62
• 附表62-63
• 讨论63-64
• 结论64-65
• 参考文献65-67
• 综述67-81
• 参考文献78-81
• 致谢81-82
• 个人简历82

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本文编号：301145