布鲁氏菌OMP25影响巨噬细胞基因表达谱的初步研究

发布时间：2017-04-12 08:17

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【摘要】：布鲁氏菌(Brucella)引起的布鲁氏菌病(以下简称布病)(Brucellosis)是一种世界性的人畜共患病,严重威胁着人类与动物的安全。外膜蛋白(outer membrane protein, OMP)是布鲁氏菌的重要毒力因子之一,OMP25蛋白是布鲁氏菌中一种主要的外膜蛋白,在布鲁氏菌的致病过程中起着重要作用。构建B.melitensis M5-90-△OMP25株,为高效布鲁氏菌疫苗的研制及布鲁氏菌致病机制的阐释提供理论依据。实验根据羊种布鲁氏菌(Brucella melitensis, B.melitensis) M5-90基因组序列和OMP25基因序列信息,设计OMP25基因的左(C)、右(N)同源臂的上、下游引物,以B.melitensis M5-90基因组为模板,应用聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction, PCR)扩增C、N同源臂片段,纯化回收目的片段。根据pEGFP-N1载体序列设计Kant基因上、下游引物,以pEGFP-N1质粒为模板扩增Kanr基因片段,并纯化回收。将C同源臂片段、Kanr片段、N同源臂片段分别用Sac I+BamHⅠ、BamHⅠ+KpnⅠ、Kpn I+Apa I双酶切,回收粘性末端,依次与相同酶切的自杀载体pGEM-7Zf(+)粘性末端进行连接转化,成功构建pGEM-7Zf-△OMP25自杀质粒。将自杀质粒电转化B.melitensis M5-90感受态细胞,用卡那霉素和氨苄霉素选择培养基筛选双同源重组B.melitensis M5-90-△OMP25株,鉴定遗传稳定性。结果成功构建遗传稳定的B.melitensis M5-90-△OMP25株。以B.melitensis M5-90株和B.melitensis M5-90-△OMP25株分别感染RAW264.7细胞4 h后,提取总RNA,分别进行Agilent基因表达谱芯片和LC Sciences microRNA Microarray-single基因表达谱芯片分析。对miRNAs芯片结果进行实时反转录聚合酶链式反应(real-time quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction, qRT-PCR)验证,结果发现,mmu-miR-146a-5p和mmu-miR-155-5p表达上调,mmu-miR-149-3p和mmu-miR-5126表达下调。Agilent基因表达谱芯片结果表明,差异显著的mRNAs有3897个,其中变化倍数2倍的mRNAs有2930个,变化倍数≥2倍的mRNAs有967个。miRNAs-mRNAs表达联合分析结果表明,qRT-PCR验证得到mmu-miR-149-3p与Bcl6b、Nos2、Ikbke、Slc31a2、Dusp16、Ifit1、Rhoc、Slc7a11、 Illrl1、Olr1有对应关系。
【关键词】：B.melitensis M5-90-△OMP25株 mRNAs miRNAs qRT-PCR 联合表达分析
【学位授予单位】：海南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.614;R378.5
【目录】：

• 摘要4-5
• Abstract5-9
• 综述一 布鲁氏菌OMP25研究进展9-11
• 综述二 基因敲除的原理、方法与应用11-23
• 1 基因敲除的原理11-12
• 2 基因敲除的方法12-21
• 2.1 敲除载体质粒的构建12-14
• 2.1.1 基因敲除载体的选择12-13
• 2.1.2 靶基因与外源标记基因的选择13-14
• 2.2 置换型质粒转化受体细胞14-16
• 2.2.1 电击穿孔转化法14-15
• 2.2.2 Ca~(2+)处理热激转化法15
• 2.2.3 PEG(聚乙二醇)介导原生质体转化法15
• 2.2.4 DNA显微注射转化法15-16
• 2.2.5 基因枪高速转化法16
• 2.2.6 农杆菌介导转化法16
• 2.3 外源基因转化细胞后筛选16-21
• 2.3.1 同源重组类型17-19
• 2.3.2 基因分析法19-20
• 2.3.3 遗传筛选法20-21
• 2.4 基因缺失后重组细胞的鉴定21
• 3 基因敲除的应用21-22
• 研究目的和意义22-23
• 第一部分 B.melitensis M5-90-△OMP25株的构建与检测23-41
• 1 实验材料23-26
• 1.1 菌株23
• 1.2 主要试剂23-24
• 1.3 仪器24
• 1.4 常用试剂配制24-26
• 2 实验方法26-34
• 2.1 B.melitensis M5-90-△OMP25株构建流程图26-27
• 2.2 B.melitensis M5-90-△OMP25株的构建27-34
• 2.2.1 B.melitensis M5-90株基因组获取27
• 2.2.2 缺失株引物设计27
• 2.2.3 目的基因扩增27-28
• 2.2.4 回收纯化PCR产物28-29
• 2.2.5 目的基因与pMD20-T载体连接29
• 2.2.6 连接产物转化29
• 2.2.7 小量提取质粒DNA29-30
• 2.2.8 重组质粒的酶切鉴定30-31
• 2.2.9 同源重组自杀载体pGEM-7Zf-△OMP25的构建31
• 2.2.10 M5-90感受态细胞的制备31-32
• 2.2.11 电转化M5-90感受态细胞32
• 2.2.12 B.melitensis M5-90-△OMP25株的筛选32
• 2.2.13 B.melitensis M5-90-△OMP25株的鉴定32-33
• 2.2.14 B.melitensis M5-90-△OMP25株的遗传稳定性检测33
• 2.2.15 B.melitensis M5-90-△OMP25株冻存33-34
• 3 结果与分析34-40
• 3.1 OMP25左同源臂、右同源臂、Kan~r基因片段PCR的扩增结果34-35
• 3.2 重组质粒的酶切鉴定35-36
• 3.3 重组质粒pGEM-7Zf-AOMP25的酶切鉴定36-37
• 3.4 B.melitensis M5-90-△OMP25株鉴定37-39
• 3.5 B.melitensis M5-90-△OMP25株的遗传稳定性检测39-40
• 4 讨论40
• 5 结论40-41
• 第二部分 感染B.melitensis M5-90-△OMP25株的RAW264.7细胞的miRNAs表达谱分析41-52
• 1 实验材料41-43
• 1.1 菌株及细胞41-42
• 1.2 主要试剂42
• 1.3 仪器42-43
• 1.4 常用试剂配制43
• 2 实验方法43-47
• 2.1 芯片样品制备43-47
• 2.1.1 RAW264.7细胞的培养43-44
• 2.1.2 冻存菌液复苏44
• 2.1.3 菌体收集44
• 2.1.4 感染RAW264.7细胞44
• 2.1.5 总RNA提取44-45
• 2.1.6 总RNA变性琼脂糖凝胶鉴定45
• 2.1.7 miRNA芯片实验45
• 2.1.8 差异miRNA鉴定与分析45-47
• 3 结果与分析47-50
• 3.1 总RNA质检结果47-48
• 3.2 差异miRNAs芯片结果48-49
• 3.3 qRT-PCR鉴定差异表达miRNAs49-50
• 4 讨论50-51
• 5 结论51-52
• 第三部分 感染B.melitensis M5-90-△OMP25株的RAW264.7细胞的mRNAs表达谱分析52-64
• 1 实验材料52-53
• 1.1 菌株及细胞52
• 1.2 主要试剂52-53
• 1.3 仪器53
• 1.4 常用试剂配制53
• 2 实验方法53-55
• 2.1 芯片样品制备53-55
• 2.1.1 RAW264.7细胞的培养53
• 2.1.2 冻存菌液复苏53
• 2.1.3 菌体收集53
• 2.1.4 感染RAW264.7细胞53
• 2.1.5 总RNA提取53
• 2.1.6 总RNA质检53
• 2.1.7 样本标记和杂交53-54
• 2.1.8 芯片结果分析流程54-55
• 3 结果与分析55-63
• 3.1 总RNA质检结果55-57
• 3.2 数据标准化结果57-60
• 3.3 GO富集结果60-62
• 3.4 差异mRNAs结果62-63
• 4 讨论63
• 5 结论63-64
• 第四部分 感染B.melitensis M5-90-△OMP25株的RAW264.7的microRNAs表达谱和mRNAs表达谱的联合分析64-75
• 1 实验材料64
• 1.1 材料64
• 1.2 主要试剂64
• 1.3 仪器64
• 1.4 常用试剂配制64
• 2 实验方法64-68
• 2.1 miRNAs-mRNAs表达联合分析64-65
• 2.2 qRT-PCR验证miRNAs-mRNAs表达联合分析预测的靶基因65-68
• 2.2.1 RNA反转录65-66
• 2.2.2 qRT-PCR验证66-68
• 3 结果与分析68-73
• 3.1 miRNAs-mRNAs表达联合分析结果68-71
• 3.2 qRT-PCR验证结果71-73
• 4 讨论73-74
• 5 结论74-75
• 创新点75
• 全文结论75-76
• 参考文献76-85
• 中英文缩写词对照表85-87
• 附录87-94
• 致谢94

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