粉尘螨新过敏原profilin蛋白克隆表达，免疫学鉴定及过敏反应机理的初步探究
发布时间：2017-04-14 20:22
本文关键词：粉尘螨新过敏原profilin蛋白克隆表达，免疫学鉴定及过敏反应机理的初步探究，由笔耕文化传播整理发布。
【摘要】：尘螨是一种全球性过敏性疾病中的的首要过敏原,有50%的过敏性疾病患者对尘螨表现出过敏反应。尘螨种类繁多,其中屋尘螨和粉尘螨是与人类过敏反应相关的两种重要致敏物种。据当前文献报道显示,粉尘螨中已发现有15种过敏原,分别为Der f1,2,3,6,7,8,10,11,14,15,16,17,18,21,24,profilin作为主要过敏原在植物花粉及食物中已被报道,但国内外尚未有关于粉尘螨profilin作为过敏原的报道。本研究以粉尘螨profilin蛋白为研究对象,通过分子生物学技术和临床实验数据相结合的方法,首次证明粉尘螨profilin是粉尘螨内一种新过敏原。目的:(1)获得粉尘螨profilin全基因序列,构建表达载体,诱导表达获得大量重组蛋白并鉴定进行临床皮肤测试(SPT)。(2)通过粉尘螨profilin重组蛋白建立小鼠过敏性哮喘模型,评价其免疫原性。(3)通过临床过敏性患者血清特异性Ig E结合检测尘螨profilin与鱼尾葵花粉和芒果果实profilin的交叉反应性。(4)通过细胞因子诱导小鼠骨髓内单核细胞分化获得DC细胞,对粉尘螨profilin的致敏机理进行初步探索。方法:(1)根据合作单位香港中文大学提供的粉尘螨profilin全基因序列设计引物,提取粉尘螨总RNA,克隆得到粉尘螨profilin蛋白基因并连接至表达载体,IPTG诱导表达菌后,获得菌体产物进行Ni-NTA亲和层析纯化并获得的高纯度蛋白。通过Ig E-Western blotting(Ig E-WB)实验、Ig E-ELISA实验和人体皮肤点刺实验(SPTs)等试验对重组蛋白进行过敏原性鉴定;(2)18只BALB/c小鼠随机分成3组,A组为粉尘螨粗提液组(DME组),B组为粉尘螨profilin重组蛋白组(profilin组),C组PBS正常对照组(control组);A组用100μg尘螨粗浸液加4mg氢氧化铝致敏,B组注射100μg尘螨重组profilin加4mg氢氧化铝致敏,C组小鼠用磷酸盐缓冲液(PBS)取代过敏原进行皮下注射。第3、7天加强致敏,在第14天将所有小鼠麻醉后,A组和B组分别用50μg尘螨粗浸液和重组profilin滴鼻激发,C组用等量的PBS代替变应原,进行滴鼻激发,每天1次,连续7天。最后一次激发24h后,所有小鼠通过全体积扫描仪进行气道高反应性检测;取血,分离脾脏,进行支气管肺泡灌洗(BALF)并对总细胞数及炎性细胞数进行统计;通过HE染色病理切片观察肺部的炎症反应;MTS试剂盒检测脾细胞增殖水平;用ELISA法检测血清中抗原特异性抗体Ig E和Ig G1,及脾细胞培养上清中INF-γ和IL-4的分泌水平。(3)与粉尘螨profilin方法类似,克隆表达获得鱼尾葵花粉和芒果profilin重组蛋白。同时分别收集20份临床粉尘螨、15份鱼尾葵花粉及15份芒果过敏性患者血清作为一抗,通过ELISA实验判断尘螨profilin与鱼尾葵花粉及芒果过敏原profilin之间的交叉反应性。将诱导获得的小鼠原代树突状细胞(DCs)分为4组,即profilin刺激组、profilin+TLR4阻断抗体组和空白对照组。通过q-PCR及Western方法检测TIM4的表达量。结果:①克隆profilin样蛋白基因序列,成功构建p ET28a-profilin表达载体,在大肠杆菌宿主菌内高效表达,经纯化获得大量可溶性重组蛋白。临床皮试点刺实验结果显示,在14例粉尘螨过敏性患者中有3例呈现出对profilin的阳性反应。Western Blot和ELISA实验也表明粉尘螨profilin与3例阳性患者的血清内Ig E有较强的结合能力,而健康对照组血清均为阴性。②由粉尘螨profilin重组蛋白建立的小鼠过敏性哮喘模型检测结果如下:A组和B组小鼠较C组肺部发生明显的炎症反应;肺泡灌洗液中嗜酸性粒细胞数显著高于C组(P㩳0.01);A组和B组血清中抗原特异性Ig E、Ig G1的分泌水平均明显高于C组,但两组之间无明显差异;脾细胞的增殖与细胞因子分泌水平变化:小鼠在受到粉尘螨粗提液及粉尘螨profilin重组蛋白刺激后增殖明显;B组小鼠脾细胞IL-4的分泌水平高于C组,而INF-γ的分泌水平低于C组。但二者与A组相比,均无显著性差异。③当粉尘螨过敏性患者血清作为一抗进行ELISA检测,鱼尾葵花粉profilin表现出60%的Ig E反应性,芒果profilin有45%的Ig E反应性。反之,以鱼尾葵花粉和芒果过敏性患者血清作为一抗时,尘螨profilin分别表现出20%和26.7%阳性反应。粉尘螨profilin在树突状细胞(DCs)表面受体TLR4介导下引起表面分子TIM4表达上调,进而引发机体Th2型过敏反应。结论:本研究通过基因工程技术克隆表达了粉尘螨过敏原profilin,经一系列鉴定表明它是粉尘螨过敏原组分中又一新发现过敏原。这为其他过敏原的发现和鉴定提供思路,同时奠定了过敏性疾病的机制研究、诊断和治疗的基础。
【关键词】：粉尘螨profilin 过敏原性 动物模型 TIM4 交叉反应性
【学位授予单位】：深圳大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R392
【目录】：
- 摘要4-6
- Abstract6-14
- 绪论14-21
- 1. 尘螨对过敏性哮喘的影响14-15
- 2. 重组过敏原的优势及研究现状15-17
- 3. 过敏性哮喘动物模型17-18
- 4. 过敏反应机理研究18-19
- 5. 本课题的研究意义19-21
- 第1章 粉尘螨profilin重组蛋白克隆表达纯化21-36
- 1.1 实验材料和方法21-30
- 1.1.1 粉尘螨、过敏性患者血清、菌种及质粒21
- 1.1.2 主要实验仪器21-22
- 1.1.3 主要实验试剂及耗材22
- 1.1.4 主要溶液配制22-25
- 1.1.5 粉尘螨profilin基因克隆及蛋白表达纯化25-29
- 1.1.6 免疫学鉴定29-30
- 1.2 结果30-35
- 1.2.1 RT-PCR扩增粉尘螨profilin片段30-31
- 1.2.2 粉尘螨profilin基因序列比对31-32
- 1.2.3 克隆表达载体构建及鉴定32-33
- 1.2.4 重组蛋白表达及纯化33
- 1.2.5 皮肤点刺33-34
- 1.2.6 Western Blot和Elisa检测临床患者血清IgE反应性34-35
- 1.3 讨论35-36
- 第2章 粉尘螨profilin过敏性哮喘小鼠模型建立36-45
- 2.1 实验材料及方法36-39
- 2.1.1 动物及致敏原蛋白36
- 2.1.2 主要实验仪器36
- 2.1.3 主要实验试剂36
- 2.1.4 主要试剂配制36
- 2.1.5 动物分组及尘螨粗浸液制备36-37
- 2.1.6 气道高反应性检测37
- 2.1.7 血清中特异性IgE和IgG1 检测37
- 2.1.8 肺泡灌洗液（BALF）中炎症细胞计数及细胞因子检测37-38
- 2.1.9 脾细胞增殖及细胞因子检测38
- 2.1.10 肺组织病理学切片38-39
- 2.1.11 统计学处理39
- 2.2 结果39-43
- 2.2.1 气道高反应性检测39-40
- 2.2.2 血清中特异性抗体IgE、IgG1 检测40
- 2.2.3 肺泡灌洗液（BALF）中炎症细胞计数及细胞因子检测40-42
- 2.2.4 淋巴细胞增殖及细胞因子检测42-43
- 2.2.5 肺组织病理学切片43
- 2.3 讨论43-45
- 第3章 粉尘螨profilin与其他物种profilin交叉反应性和致敏机理初步探究45-53
- 3.1 实验材料及方法45-47
- 3.1.1 实验动物及主要试剂45
- 3.1.2 主要实验仪器45
- 3.1.3 表达纯化重组蛋白45
- 3.1.4 粉尘螨与鱼尾葵花粉profilin交叉反应性45-46
- 3.1.5 粉尘螨与芒果profilin交叉反应性46
- 3.1.6 诱导分化获得小鼠原代树突状细胞（BMDCs）46
- 3.1.7 过敏原刺激原代树突状细胞（DCs）46
- 3.1.8 Western Blot检测TIM4 蛋白表达46-47
- 3.1.9 实时荧光定量PCR检测DC细胞表面分子TIM4 蛋白表达47
- 3.2 结果47-51
- 3.2.1 表达纯化获得三种profilin蛋白47
- 3.2.2 粉尘螨profilin与鱼尾葵花粉profilin交叉反应性47-48
- 3.2.3 粉尘螨profilin与芒果profilin蛋白之间的交叉反应性48-49
- 3.2.4 DCs在粉尘螨profilin刺激下表面分子TIM4 上调 .. 3649-51
- 3.3 讨论51-53
- 结论53-54
- 参考文献54-60
- 附录60-63
- 致谢63-64
- 攻读硕士学位期间的研究成果64-65
【参考文献】
中国期刊全文数据库 前3条
1 马萍;邢杰;闫玉文;;过敏性支气管哮喘动物模型研究现状[J];武警医学院学报;2010年08期
2 郝敏麒,徐军,钟南山;尘螨致敏小鼠肺部变应性炎症模型的建立[J];中国病理生理杂志;2003年01期
3 李国平 ,刘志刚 ,钟南山;重组Derp2变应原诱导小鼠变态反应气道炎症动物模型的建立[J];中华微生物学和免疫学杂志;2005年07期
本文关键词：粉尘螨新过敏原profilin蛋白克隆表达，免疫学鉴定及过敏反应机理的初步探究，由笔耕文化传播整理发布。
，本文编号：306795
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