大鼠骨髓间充质干细胞多向分化能力鉴定及分化相关基因时序性表达分析

发布时间：2017-04-14 12:03

  本文关键词：大鼠骨髓间充质干细胞多向分化能力鉴定及分化相关基因时序性表达分析，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)是干细胞家族的重要成员,中胚层和外胚层发育早期生成,属于多能干细胞,间充质干细胞(MSCs)最初在骨髓中发现,因其具有多向分化潜能,造血支持和促进干细胞植入,免疫调控和自我复制,来源广泛,获取简单易于分离培养,体外增殖力强,可进行自体移植而不存在组织配型,免疫排斥和医学伦理方面的问题等特点而日益受到人们的关注[1]。目前发现其具有能够分化形成至7种组织细胞,如成骨细胞、成软骨细胞、成脂细胞、成肌细胞等组织细胞的潜能。可以为骨、软骨、肌肉等结缔组织的损伤修复提供潜在的细胞来源,被认为是骨组织工程中最佳的种子细胞[2]。目的:实验旨在建立一套简便有效的骨髓间充质干细胞原代培养、诱导分化及染色方法,观测骨髓间充质干细胞生物学特性,及其成骨、成脂分化潜能,检测其分化过程中不同时期相关基因表达量变化,为后续进行骨髓间充质干细胞分化过程各基因功能差异分析实验做好准备。方法:本实验通过全骨髓培养法分离骨髓间充质干细胞,并用诱导分化培养液做定向诱导培养,观察骨髓间充质干细胞向成骨及成脂肪细胞分化过程中的细胞形态学变化,进行成骨成脂细胞染色鉴定,以探讨骨髓间充质干细胞的分离培养方法、生长规律及向成骨成脂细胞分化的条件。应用实时荧光定量PCR检测成骨分化标志ALP、OCN、Runx2基因及成脂肪分化标志性基因PPARγ、FABP4的表达。结果:(1)通过全贴壁法成功进行了骨髓间充质干细胞原代及传代培养并绘制出第4代细胞生长曲线;(2)通过茜素红染色验证了骨髓间充质干细胞的成骨分化能力;(3)通过油红O染色验证骨髓间充质干细胞的成脂分化能力;(4)通过RT-PCR测得各标志基因在诱导过程中各不同时相表达量变化。结论:全贴壁法提取的大鼠骨髓间充质干细胞经传代4次左右可达到一定纯度,在一定诱导条件下,经特定染色方法鉴定,可分化为成骨细胞,脂肪细胞;Runx2、ALP、OCN及PPARγ、FABP4的表达量随诱导时间延长而变化,从而对分化过程分别进行调节。
【关键词】：骨髓间充质干细胞 诱导分化 染色
【学位授予单位】：济南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R329.2
【目录】：

• 摘要7-8
• ABSTRACT8-9
• 主要符号表9-10
• 前言10-23
• 1 BMSCs研究进展10-19
• 1.1 BMSCs的来源与应用10-12
• 1.2 BMSCs的多向分化12-14
• 1.2.1 成骨分化12-13
• 1.2.2 成脂肪分化13
• 1.2.3 骨髓间充质干细胞的分化调控机制13-14
• 1.3 BMSCs的应用前景14-19
• 1.3.1 BMSCs与骨性关节炎的治疗15-16
• 1.3.2 BMSCs与股骨头缺血性坏死的治疗16-17
• 1.3.3 BMSCs与白血病的治疗17-18
• 1.3.4 BMSCs与糖尿病溃疡的治疗18-19
• 2 成骨及成脂肪分化相关基因19-23
• 第一章 大鼠骨髓间充质干细胞多向分化诱导及染色鉴定23-37
• 1 材料与方法23-31
• 1.1 实验动物材料23-25
• 1.1.1 试剂23-24
• 1.1.2 仪器24-25
• 1.2 方法25-31
• 1.2.1 BMSCs的提取分离及体外培养25-27
• 1.2.2 P_4细胞生长曲线测定27
• 1.2.3 BMSCs成骨分化（osteogenesis differentiation，OD）及茜素红27-29
• 1.2.4 BMSCs成脂肪分化（adipogenic differentiation，AD）及油红O染色29-31
• 2 结果31-35
• 2.1 BMSCs各代细胞形态31-32
• 2.2 P_4细胞生长曲线绘制32-33
• 2.3 BMSCs成骨分化茜素红染色结果33-34
• 2.4 BMSCs成脂肪分化油红O染色结果34-35
• 3 讨论35-37
• 第二章 大鼠骨髓间充质干细胞分化相关基因各时相表达量差异分析37-44
• 1 材料与方法37-41
• 1.1 材料37-38
• 1.1.1 细胞37
• 1.1.2 试剂37
• 1.1.3 仪器37-38
• 1.2 方法38-41
• 1.2.1 BMSCs成骨、成脂分化诱导及种板38
• 1.2.2 BMSCs成骨、成脂诱导各时相RNA提取38-39
• 1.2.3 cDNA合成39
• 1.2.4 实时荧光定量PCR39-40
• 1.2.5 统计学方法分析40-41
• 2 结果41-42
• 2.1 P_4细胞成骨诱导各时相标志基因表达量变化41
• 2.2 P_4细胞成脂肪诱导各时相标志基因表达量变化41-42
• 3 讨论42-44
• 参考文献44-53
• 在校期间发表论文53-54
• 致谢54

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