共培养诱导间充质干细胞成软骨分化以及培养方式对软骨细胞表型的影响

发布时间：2021-03-29 19:45

　　工程化软骨组织存在性能差和软骨表型不稳定的问题。本文基于海藻酸凝胶微球体系,针对细胞与细胞以及细胞与材料间的相互作用对于间充质干细胞（Mesenchymal stem cells,MSCs）或软骨细胞软骨表型的影响,主要开展了以下三部分研究工作:首先,借助Transwell的间接共培养体系,考察了兔骨髓MSCs（rabbit MSCs,rMSCs）与兔关节软骨（rabbit articular chondrocytes,rACs）细胞共培养的条件下的成软骨分化。我们发现,在共培养过程中,rMSC持续分泌软骨特性基质糖胺聚糖（Glycosaminoglycan,GAG）,在第7-14天,软骨相关基因Col Ⅱ、COMP和Aggrecan表达量显著上调,在第28天肥大化相关基因Col Ⅹ和MMP13的表达量显著下调。因此,通过与rACs的间接共培养,能够促进并维持rMSCs的成软骨分化表型。其次,基于转瓶培养体系,制备了自发聚集的rACs细胞团和载有rACs的微载体,并经海藻酸包埋后考察了 rACs的生长和分化情况。我们发现,培养14天后,两者均无增殖现象,但表现出GAG的累积,而且微载体... 

【文章来源】：华东理工大学上海市 211工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：84 页

【学位级别】：硕士

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摘要
Abstract
第1章 绪论
    1.1 关节软骨组织
    1.2 关节软骨损伤的临床治疗
    1.3 软骨组织工程
        1.3.1 生物支架材料
        1.3.2 种子细胞
            1.3.2.1 软骨细胞
            1.3.2.2 干细胞
    1.4 培养方式对软骨细胞表型的影响
    1.5 MSCs成软骨诱导分化的研究
    1.6 共培养在软骨组织工程中的应用
        1.6.1 共培养
        1.6.2 基于共培养诱导MSCs成软骨分化
    1.7 研究内容、目的和意义
第2章 海藻酸凝胶中MSCs与软骨细胞间接共培养成软骨分化研究
    2.1 前言
    2.2 材料与方法
        2.2.1 主要实验试剂及来源
        2.2.2 细胞分离和培养
        2.2.3 细胞包埋
        2.2.4 共培养实验设计
        2.2.5 死活染色
        2.2.6 MTT测定
        2.2.7 DNA、GAG定量检测
        2.2.8 冷冻切片和石蜡切片制备
        2.2.9 H&E染色
        2.2.10 番红-O染色
        2.2.11 天狼猩红染色
        2.2.12 免疫组化染色
        2.2.13 扫描电子显微镜
        2.2.14 RT-PCR
        2.2.15 统计学分析
    2.3 结果
        2.3.1 rMSCs在海藻酸钠凝胶微球中的生长状况
            2.3.1.1 死活染色
            2.3.1.2 MTT检测和DNA含量
            2.3.1.3 组织学分析
            2.3.1.4 SEM观察
        2.3.2 rACs在海藻酸钠水凝胶微球中的生长状况
            2.3.2.1 死活染色
            2.3.2.2 MTT检测以及DNA和GAG含量
            2.3.2.3 组织学分析
            2.3.2.4 SEM观察
        2.3.3 在共培养中rMSCs的成软骨分化
            2.3.3.1 rMSCs凝胶微球的死活染色
            2.3.3.2 MTT、DNA和GAG检测
            2.3.3.3 组织学分析
            2.3.3.4 rMSCs的基因表达分析
    2.4 讨论
    2.5 结论
第3章 培养方式对软骨细胞在海藻酸凝胶微球中表型的影响
    3.1 前言
    3.2 材料和方法
        3.2.1 rACs分离与培养
        3.2.2 基于微载体培养rACs
        3.2.3 软骨聚团制备
        3.2.4 海藻酸凝胶微球包埋
        3.2.5 死活染色
        3.2.6 MTT检测
        3.2.7 DNA和GAG定量测定
        3.2.8 石蜡切片制备
        3.2.9 H&E染色
        3.2.10 番红-O染色
        3.2.11 免疫荧光染色
    3.3 结果
        3.3.1 基于微载体的rACs转瓶培养
        3.3.2 rACs聚团的制备
        3.3.3 海藻酸凝胶微球中rACs的死活染色
        3.3.4 海藻酸凝胶微球中rACs的MTT、DNA和GAG检测
        3.3.5 组织学分析
    3.4 讨论
    3.5 本章小结
第4章 MSCs在氧化处理的海藻酸凝胶微球中成软骨分化研究
    4.1 概述
    4.2 材料与方法
        4.2.1 氧化处理海藻酸钠
        4.2.2 傅里叶红外光谱（FTIR）
        4.2.3 溶胀曲线
        4.2.4 降解曲线
        4.2.5 细胞包埋
        4.2.6 死活染色
        4.2.7 MTT检测
        4.2.8 DNA、GAG含量测定
        4.2.9 H&E染色
        4.2.10 番红-O染色
        4.2.11 统计学分析
    4.3 结果与讨论
        4.3.1 氧化海藻酸的红外表征结果
        4.3.2 海藻酸凝胶微球的溶胀和降解行为
        4.3.3 海藻酸凝胶微球的微观结构
        4.3.4 rMSCs在海藻酸凝胶微球中的活性
        4.3.5 MTT、DNA和GAG检测
        4.3.6 组织学染色
    4.4 讨论
    4.5 本章小结
第5章 全文总结和展望
参考文献
致谢



本文编号：3108089