抗癌胚抗原（CEACAM 6）纳米抗体的表达、纯化及初步活性鉴定

发布时间：2017-04-19 16:17

  本文关键词：抗癌胚抗原（CEACAM 6）纳米抗体的表达、纯化及初步活性鉴定，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：纳米抗体(Nanobody,Nb)即单域抗体(Variable domain of heavy chainof heavy-chain antibody,VHH),是骆驼科动物体内天然存在的重链抗体的可变区域。纳米抗体分子量小,大约15 KD左右,与传统抗体的可变区相比有两个显著区别:纳米抗体FR2区四个疏水性氨基酸突变为亲水性氨基酸,增加了其在溶液中的溶解性;纳米抗体CDR1和CDR3高变区比较长,分子内部通过二硫键形成弯曲的长臂可以与靶点表面或者隐蔽的抗原结合位点结合,提高了纳米抗体自身稳定性以及与抗原的结合能力。纳米抗体在许多领域都有着广泛的应用,例如在食品行业中可以中和毒素,检测食品中微生物含量确保食品安全性等;在生命科学基础研究中,通过构建单价或者多价纳米抗体复合物,提高抗体与抗原的结合力,也可用有机染料或者生物标记物修饰纳米抗体用于分子成像,研究体内外细胞结构等;在疾病诊断方面,纳米抗体可以鉴别临床样本中病原微生物的种类;在肿瘤靶向治疗方面,将治疗性药物与纳米抗体共载,提高肿瘤靶向治疗的效果等。由于肿瘤标志物在肿瘤的诊断和治疗当中发挥着至关重要的作用,因此高特异性、专一性好的肿瘤标志物的筛选是亟待解决的难题。随着纳米抗体的发现和研究,在临床样本中应用纳米抗体筛选和检测肿瘤标志物为肿瘤早期诊断提供了便利,因此纳米抗体的发展和应用在肿瘤标志物的筛选以及肿瘤的抗体靶向治疗药物研发过程中具有巨大潜力。随着基因工程的发展,利用不同的宿主,使得目的蛋白的大量生产成为可能。人们可以根据自己的意愿设计改造目的蛋白的基因序列,与具有不同功能的表达载体构建在一起,转化到宿主体内后进行发酵生产,例如原核表达系统(大肠杆菌,Escherichia Coli)、真核表达系统(巴斯德毕赤酵母酵母,Pichia pastoris和酿酒酵母,Cerevisiae)等。原核表达系统具有操作简单、成本低廉、基因背景影响较低、外源蛋白表达量高等特点,适合纳米抗体这种结构简单的小分子蛋白的生产。本实验将从羊驼纳米抗体库内筛选出的三种不同亲和力的抗CEACAM 6纳米抗体(Nb15、Nb35和Nb37),并将含有纳米抗体的质粒转化到TG1大肠杆菌中,并利用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达。分别对诱导表达所需的诱导剂浓度、诱导温度和诱导时间进行优化,确立了纳米抗体最适诱导表达条件;利用镍柱进行亲和层析,筛选最适咪唑洗脱浓度并进行大量纯化,获得较高纯度和浓度的纳米抗体蛋白样品;经过PBS透析除盐,利用流式细胞术检测不同肿瘤细胞表面CEACAM 6抗原含量,验证纳米抗体与肿瘤细胞表面抗原的结合活性,筛选确定人乳腺癌细胞MCF-7为CEACAM 6高表达细胞株;接着利用MCF-7肿瘤细胞筛选确定亲和力最优纳米抗体为Nb15-2;最后将纳米抗体Nb15-2逐步进行弱阴离子交换层析与亲和层析进行提纯优化,得到纯度为99.6%的纳米抗体蛋白,有效的提高了纳米抗体蛋白的纯度。为纳米抗体工业化生产、疾病诊断与肿瘤靶向治疗的应用奠定理论基础。
【关键词】：纳米抗体 表达 纯化 肿瘤标志物 靶向治疗
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q78;R392
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstarct6-12
• 第一章 前言12-21
• 1.1 纳米抗体的简介12-18
• 1.1.1 抗体的发展12-14
• 1.1.2 纳米抗体的结构与生物学特性14-16
• 1.1.3 纳米抗体的应用16-18
• 1.2 癌胚抗原18-21
• 1.2.1 肿瘤标志物18
• 1.2.2 CEACAM 618-21
• 第二章 材料与方法21-39
• 2.1 主要材料试剂及实验设备21-25
• 2.1.1 菌株和质粒21
• 2.1.2 仪器与设备21-22
• 2.1.3 实验材料及试剂22-23
• 2.1.4 常用溶液的配制23-25
• 2.2 三种纳米抗体的诱导表达25-30
• 2.2.1 纳米抗体原核表达菌株的鉴定25-28
• 2.2.2 三种纳米抗体高表达菌株的筛选28-29
• 2.2.3 Nb15-2、Nb35-2 和Nb37-1 诱导表达条件优化29-30
• 2.3 Nb15-2、Nb35-2 和Nb37-1 的纯化30-35
• 2.3.1 Nb15-2、Nb35-2 和Nb37-1 可溶性验证30-32
• 2.3.2 Nb15-2、Nb35-2 和Nb37-1 纯化条件筛选32-34
• 2.3.3 Nb15-2、Nb35-2 和Nb37-1 大量纯化34-35
• 2.4 纳米抗体初步活性研究35-39
• 2.4.1 流式细胞术筛选CEACAM 6 高表达肿瘤细胞株35-37
• 2.4.2 纳米抗体亲和力分析37
• 2.4.3 纳米抗体Nb15-2 的提纯优化37-39
• 第三章 实验结果39-53
• 3.1 纳米抗体阳性表达菌株的鉴定39-40
• 3.1.1 pSJF2-15、pSJF2-35和pSJF2-37质粒双酶切39
• 3.1.2 pSJF2-15、pSJF2-35和pSJF2-37序列比对39-40
• 3.2 三种纳米抗体诱导表达40-45
• 3.2.1 IPTG小量快速诱导表达40-41
• 3.2.2 诱导表达条件优化41-45
• 3.3 纳米抗体的纯化45-49
• 3.3.1 纳米抗体诱导表达可溶性分析45-46
• 3.3.2 纳米抗体诱导表达蛋白Western blot验证46
• 3.3.3 纳米抗体亲和层析条件筛选46-48
• 3.3.4 纳米抗体大量纯化48
• 3.3.5 大量纯化的纳米抗体蛋白Western blot验证48-49
• 3.3.6 蛋白浓度测定49
• 3.4 纳米抗体的初步活性分析49-53
• 3.4.1 CEACAM 6 高表达肿瘤细胞的筛选49-50
• 3.4.2 纳米抗体亲和力分析50-52
• 3.4.3 纳米抗体Nb15-2 的提纯优化52-53
• 第四章 讨论53-55
• 第五章 结论55-56
• 第六章 参考文献56-60
• 第七章 致谢60

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前6条

1 李策;聂彩辉;张力君;徐寒梅;;肿瘤标志物的应用及其筛选技术研究进展[J];药学进展;2014年01期

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3 贺晓旭;徐济责;;抗体工程的研究进展[J];现代农业科学;2009年04期

4 胡春艳;刘全忠;;单克隆抗体制备技术及应用的研究进展[J];安徽预防医学杂志;2008年02期

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本文编号：316670