利用TALEN和CRISPR/Cas9技术构建甲型血友病小鼠模型

发布时间：2021-05-11 09:45

　　人类甲型血友病是FVⅢ基因突变所产生的罕见遗传性疾病。甲型血友病小鼠模型可用于该疾病的药物研发、预防和治疗手段等研究。已有基于ES同源重组制作的基因敲除小鼠模型,但该方法效率低、周期长、成本高。随着ZFN、TALEN和CRISPR/Cas9技术的发展,尤其是TALEN和CRISPR/Cas9技术具有高效率、易操作、短周期、低费用等优势,成为应用最广泛的基因编辑技术,使制备基因敲除小鼠模型更为便捷。本课题分别通过TALEN和CRISPR/Cas9技术敲除小鼠的FVⅢ基因,构建甲型血友病小鼠模型。在细胞水平和动物个体上比较了两种技术的效率,验证了敲除的FVⅢ基因在后裔中传递的规律,并分析了基因敲除小鼠的表型。以小鼠FVⅢ基因第三外显子为靶向,构建TALEN核酸酶表达载体。细胞实验显示5对TALEN组合（T1-T5）中只有2对（T2、T5）发生基因编辑,突变率分别为16%和38%。动物实验显示将5对TALEN组合的mRNA分别注射至62、145、112、89、119枚胚胎,获得57、140、92、81、114枚存活胚胎并移植至受体,出生10、39、26、0、28只小鼠。T7EI检测和测序验证... 

【文章来源】：南京师范大学江苏省 211工程院校

【文章页数】：77 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章 文献综述
    1.1 基因编辑技术
        1.1.1 基于ES打靶的同源重组技术
        1.1.2 核酸酶介导的基因编辑技术
            1.1.2.1 ZFN技术
            1.1.2.2 TALEN技术
            1.1.2.3 CRISPR/Cas9技术
    1.2 FVⅢ与甲型血友病
        1.2.1 FVⅢ结构与功能
        1.2.2 甲型血友病
            1.2.2.1 甲型血友病的临床表现
            1.2.2.2 甲型血友病的发病机制
    1.3 甲型血友病小鼠模型的研究意义
第二章 TALEN技术介导的FVⅢ基因敲除小鼠的制备
    2.1 实验材料
        2.1.1 实验材料和试剂
        2.1.2 实验仪器
    2.2 实验方法
        2.2.1 载体构建
            2.2.1.1 设计TALEN识别序列
            2.2.1.2 载体构建
        2.2.2 TALEN对培养细胞的基因编辑
            2.2.2.1 细胞转染
            2.2.2.2 转染细胞提取基因组
            2.2.2.3 提取细胞基因组进行PCR扩增
            2.2.2.4 T7EI检测细胞基因组PCR产物
        2.2.3 TALEN对动物个体的基因编辑
            2.2.3.1 TALEN表达质粒体外转录mRNA
            2.2.3.2 显微注射mRNA和胚胎移植
            2.2.3.3 F0代小鼠的突变检测
    2.3 实验结果
        2.3.1 TALEN载体构建
        2.3.2 TALEN对培养细胞的基因编辑
        2.3.3 TALEN对动物个体的基因编辑
            2.3.3.1 TALEN质粒体外转录mRNA
            2.3.3.2 mRNA注射和胚胎移植
            2.3.3.3 F0代小鼠的突变检测
第三章 CRISPR/Cas9技术介导的FVⅢ基因敲除小鼠的制备
    3.1 实验材料和试剂
    3.2 实验方法
        3.2.1 CRISPR/Cas9载体构建
            3.2.1.1 CRISPR/Cas9 gRNA设计
            3.2.1.2 CRISPR/Cas9载体构建
        3.2.2 CRISPR/Cas9对培养细胞的基因编辑
            3.2.2.1 细胞转染
            3.2.2.2 突变检测
            3.2.2.3 脱靶检测
        3.2.3 CRISPR/Cas9对动物个体的基因编辑
            3.2.3.1 体外转录gRNA和Cas9 mRNA
            3.2.3.2 显微注射mRNA和胚胎移植
            3.2.3.3 阳性小鼠检测和T-A克隆测序
    3.3 实验结果与分析
        3.3.1 载体构建
        3.3.2 CRISPR/Cas9对细胞基因组的编辑
        3.3.3 CRISPR/Cas9对小鼠基因组的编辑
            3.3.3.1 体外转录gRNA和Cas9 mRNA
            3.3.3.2 显微注射mRNA和胚胎移植
            3.3.3.3 F0代小鼠的突变检测
第四章 FVⅢ基因敲除小鼠后裔的突变检测与繁育
    4.1 实验材料和试剂
    4.2 实验方法
        4.2.1 FVⅢ基因敲除小鼠后裔的突变检测
        4.2.2 FVⅢ基因敲除小鼠后裔的繁育
    4.3 实验结果与分析
        4.3.1 敲除小鼠后裔的突变检测
        4.3.2 FVⅢ基因敲除小鼠后裔的繁育
第五章 FVⅢ基因敲除小鼠的表型分析
    5.1 实验材料和试剂
    5.2 实验方法
        5.2.1 凝血反应检测
            5.2.1.1 活化部分凝血酶原时间(APTT)测定
            5.2.1.2 凝血酶原时间(PT)测定
        5.2.2 蛋白质免疫印迹检测FVⅢ
    5.3 实验结果
        5.3.1 FVⅢ基因敲除小鼠凝血途径的检测
        5.3.2 FVⅢ基因敲除小鼠的蛋白表达分析
第六章 讨论与结论
    6.1 TALEN和CRISPR/Cas9技术比较
    6.2 胚胎胞质注射TALEN mRNA产生Mosaic小鼠的讨论
    6.3 FVⅢ基因敲除小鼠表型分析探讨
    6.4 结论
第七章 展望
附录
参考文献
在读期间发表的学术论文及研究成果
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]Efficient and Specific Modifications of the Drosophila Genome by Means of an Easy TALEN Strategy[J]. Jiyong Liu~a,Changqing Li~a,Zhongsheng Yu~a,Peng Huang~b,Honggang Wu~a,Chuanxian Wei~a, Nannan Zhu~a,Yan Shen~b,Yixu Chen~a,Bo Zhang~b,Wu-Min Deng~(c,*),Renjie Jiao~(a,*) a State Key Laboratory of Brain and Cognitive Science,Institute of Biophysics,The Chinese Academy of Sciences,Datun Road 15,Beijing 100101,China b Key Laboratory of Cell Proliferation and Differentiation of Ministry of Education,College of Life Sciences,Peking University,Beijing 100871,China c Department of Biological Science,Florida State University,Tallahassee,Florida 32304-4295,USA.  遗传学报. 2012(05)
[2]CRISPR-Cas系统与细菌和噬菌体的共进化[J]. 李铁民,杜波.  遗传. 2011(03)
[3]小鼠基因修饰基本原理及其在医学研究中的应用——2007年诺贝尔生理学或医学奖及其相关工作介绍[J]. 汤富磊,冯娟.  生理科学进展. 2008(03)
[4]DNA双链断裂损伤修复系统研究进展[J]. 黄敏,缪泽鸿,丁健.  生理科学进展. 2007(04)
[5]凝血因子Ⅷ结构与功能关系的研究进展[J]. 谢飞,王鸿利.  国外医学.临床生物化学与检验学分册. 2005(12)



本文编号：3181192