抗TRPM2兔单克隆抗体制备及初步鉴定

发布时间：2017-04-22 18:06

  本文关键词：抗TRPM2兔单克隆抗体制备及初步鉴定，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：背景抗体从多克隆发展到单克隆抗体药物,已被广泛应用于生物科学及医药研发技术产品中。相比鼠单克隆抗体而言,兔单克隆抗体具有高亲和力,特异性强,易于人源化等优点。TRPM2(Transient receptor potential channels melastatin,瞬时受体电位通道M型2)是Ca2+非选择性阳离子通道,受ADPR(Adenosine diphosphate ribose,二磷酸腺苷核糖)和H202激活调控胞内Ca2+浓度,从而对细胞的各项生理功能进行调控,与能量代谢修复和氧化应激相关的病理性疾病有关。目前市面上主要是TRPM2多克隆抗体,其特异性和亲和力并不是十分理想。目的制备TRPM2兔单克隆抗体。方法本实验设计合成了三段TRPM2多肽,YCA-10987, YCA-10988和YCA-10989,每段多肽免疫三只实验兔。经过血清blot实验初步筛选,将可能免疫了TRPM2兔脾细胞与240E兔骨髓瘤样细胞株融合,产生能分泌TRPM2抗体的兔-兔杂交瘤细胞,用HAT作为选择性培养基对融合后的细胞进行培养,运用ELISA法和WB法,筛选获得阳性克隆,选取其中WB信号最强的克隆进入抗体质粒重组阶段,再进一步筛选,选取分泌单克隆抗体最强的配对进入单克隆抗体大转生产。结果YCA-10988免疫失败。YCA-10987和YCA-10989在WB应用上有差异,YCA-10987在过表达裂解液中能检测出强信号,但在细胞裂解液中检测出很弱的信号,而YCA-10989与YCA-10987相反。结论本实验设计合成了三段TRPM2多肽,通过杂交瘤和重组技术,获得YCA-10987和YCA-10989两个不同位点TRPM2兔单克隆抗体,两者在WB应用上有差异,但可满足检测需要,有潜在应用前景。
【关键词】：兔单克隆抗体 TRPM2
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R392
【目录】：

• 致谢5-6
• 主要缩略词6-7
• 摘要7-8
• ABSTRACT8-12
• 1 绪论12-23
• 1.1 多克隆抗体技术12
• 1.2 单克隆抗体技术12-17
• 1.2.1 单克隆抗体技术研究历史和现状12-13
• 1.2.2 单克隆抗体技术研究原理13-14
• 1.2.3 制备单克隆抗体的骨髓瘤细胞14-15
• 1.2.4 兔单克隆抗体优势15-17
• 1.3 TRP通道17-23
• 1.3.1 TRPM2的命名和分子结构18-19
• 1.3.2 TRPM2分布19
• 1.3.3 TRPM2与中枢神经系统退行性疾病19-23
• 2 抗TRPM2兔单克隆抗体杂交瘤细胞的制备23-36
• 引言23
• 2.1 实验材料23-26
• 2.1.1 免疫原23
• 2.1.2 细胞来源23-24
• 2.1.3 实验动物24
• 2.1.4 主要仪器设备24
• 2.1.5 主要试剂及配置24-26
• 2.2 实验方法26-31
• 2.2.1 免疫26
• 2.2.2 抗血清效价测定26-27
• 2.2.3 血清特异性检测27-30
• 2.2.4 细胞融合30-31
• 2.3 实验结果与分析31-35
• 2.3.1 兔抗血清效价31-32
• 2.3.2 血清WB初步判定32-34
• 2.3.3 细胞融合结果34-35
• 2.4 讨论35-36
• 3 抗TRPM2兔单克隆抗体重组开发36-48
• 引言36
• 3.1 实验材料36-37
• 3.1.1 TRPM2抗体基因序列36
• 3.1.2 细胞来源36
• 3.1.3 主要仪器设备36
• 3.1.4 主要试剂36-37
• 3.2 实验方法37-43
• 3.2.1 制备重组抗体37-43
• 3.3 重组技术生产TRPM2兔单克隆抗体结果43-47
• 3.3.1 HC和LC PCR结果43
• 3.3.2 HC质粒和LC质粒酶切结果43
• 3.3.3 小转检测结果43-44
• 3.3.4 大转检测结果44-47
• 3.5 讨论47-48
• 4 总结与展望48-49
• 参考文献49-54

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