SFTSV核酸检测试剂盒国家参考品的研制和乙型脑炎病毒E蛋白的研究

发布时间：2017-04-25 21:14

  本文关键词：SFTSV核酸检测试剂盒国家参考品的研制和乙型脑炎病毒E蛋白的研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：第一部分发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒核酸检测试剂盒国家参考品的研制【目的】发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒(SFTSV)是首次在中国出现并由国内专家分离到的一种新病毒,病死率高达10%。目前针对该病毒尚无有效的疫苗和药物。为了有效控制该疾病传播,对其快速、准确诊断是基础。市场上出现了各种检测试剂盒,但尚无关于SFTSV检测试剂盒的相关标准品。为了对此类试剂盒等进行科学有效的质量控制,本文研制了SFTSV核酸检测试剂盒的国家参考品。【方法】本研究按照国家参考品建立的相关规定和SFTSV的生物学特点,分别筛选出符合要求的阳性参考品和阴性参考品,并通过测序验证和荧光定量PCR验证进行确认,确保参考品的准确性和特异性。在此基础上,将阳性参考品HB29株病毒系列稀释,以此考察试剂盒的最低检出限,从而确定参考品的灵敏度,并通过检测稀释至104U/mL的HB29株病毒Ct值的变异系数来确定参考品的精密度。本研究建立的参考品已组织不同实验室进行协作标定,以确定参考品的特性值。参考品完成之后进行不同温度和反复冻融条件下的稳定性实验,考察参考品的稳定性。【结果】根据参考品应具有的广谱性和代表性最终确定了6株阳性参考品和5株阴性参考品,基因测序和荧光定量PCR验证实验均证明了参考品的准确性。通过对SFTSV HB29株病毒系列稀释后的最低检出限实验,结合临床上病人血清的病毒载量,确定102U/mL的病毒量作为参考品的最低检出限,即含量为102U/mL必须检测为阳性,低于102U/mL不作要求。结合各个试剂盒的检测结果,确定本精密度参考品的Ct值的变异系数应不高于5.0%。协作标定各实验室结果均与本实验室实验结果一致。稳定性实验结果证明本参考品在不同温度和反复冻融条件下稳定性良好。目前本参考品已通过国家标准物质委员会批准,作为SFTSV核酸检测试剂盒国家第一代参考品,其批准文号为:(2015)国生参字0065。【结论】本研究建立了SFTSV核酸检测试剂盒国家参考品,填补了国内尚无SFTSV相关参考品的空缺,能够对检测试剂盒进行良好的质量控制,保证试剂盒能快速准确地检测出病人血清中的SFTSV,从而更加科学有效的促进SFTSV的预防控制工作。第二部分乙型脑炎病毒E蛋白的研究【目的】乙型脑炎(JE)减毒活疫苗SA14-14-2是我国自主研发的一种疫苗,对乙脑的流行和控制起着重要作用,自投产以来在国内外得到广泛应用。为了从分子、原子水平探讨乙型脑炎减毒株SA14-14-2弱毒力稳定、免疫原性良好的理论基础,解析JEV SA14-14-2蛋白中与病毒毒力和免疫原性相关的病毒蛋白质结构。通过原核表达获得乙脑病毒E蛋白,通过X射线衍射技术,对该蛋白晶体进行结构解析,结合不同的乙脑病毒E蛋白的生物学功能,探索JEV SA14-14-2的免疫原性和减毒机理。【方法】本研究将原核表达载体p QE C3与乙脑病毒E基因构建重组质粒,验证正确后导入到受体菌BL21内,以IPTG诱导目的蛋白表达,高压破碎细菌后收获E蛋白包涵体。再通过镍柱亲和层析、折叠复性和凝胶过滤层析对表达的蛋白进行纯化。获得的目的蛋白一部分用于晶体结构解析,另一部分以不同剂量(80μg/只、120μg/只)免疫Balb/c小鼠,分别进行免疫攻击保护力实验和血清中和抗体检测,以解析其生物学功能。【结果】原核表达载体p QE C3与乙脑病毒包膜糖蛋白E基因连接完成,获得了重组载体,转化入表达菌BL21内,并鉴定正确,获得了阳性克隆。用LB培养基培养,IPTG诱导后收获目的蛋白包涵体,经过复性、纯化后获得JEV SA14-14-2、SA14-5-3、SA14-9-7 E蛋白,其中一部分蛋白用于E蛋白晶体结构解析,获得了晶体。另一部分进行E蛋白免疫原性研究,结果显示,SA14-14-2 E蛋白免疫后中和抗体水平最高,达1:23,血清阳转率达100%。中和抗体水平和血清阳转率高低趋势均为SA14-14-2SA14-5-3SA14-9-7,与三株病毒原型株的免疫原性高低趋势相符。E蛋白保护力实验结果显示三组蛋白均呈现出一定的保护力,但差异不明显。【结论】本研究通过原核表达收获乙型脑炎病毒E蛋白,为深入研究该蛋白生物学功能和晶体结构解析提供了条件,进一步为解析乙脑病毒的致病机理、乙脑减毒活疫苗毒株SA14-14-2的减毒机理和疫苗的质量控制奠定了技术基础。SA14-14-2 E蛋白的中和抗体水平结果表明其蛋白的免疫原性高于SA14-5-3和SA14-9-7,这与三株病毒的免疫原性下降趋势相符,推测E蛋白是影响乙脑病毒的免疫原性改变的关键蛋白。由于三组蛋白的免疫保护力差异不明显推测病毒的致病机理可能还与其他非结构蛋白有关。
【关键词】：SFTSV 荧光定量 PCR 核酸检测试剂盒 参考品乙型脑炎病毒 原核表达 蛋白纯化 免疫原性 晶体解析
【学位授予单位】：中国食品药品检定研究院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R392
【目录】：

• 摘要5-7
• Abstract7-10
• 第一部分SFTSV核酸检测试剂盒国家参考品的研制10-52
• 前言10-12
• 材料和方法12-26
• 1、实验材料12-13
• 2、实验方法13-26
• 实验结果26-49
• 1、阳性参考品的建立26-31
• 2、阴性参考品的建立31-36
• 3、灵敏度参考品的确定36-40
• 4、精密度参考品的确定40-42
• 5、研究仪器选用说明42
• 6、参考品的协作标定42
• 7、参考品的稳定性研究42-49
• 讨论49-51
• 总结51-52
• 第二部分 乙型脑炎病毒E蛋白的研究52-88
• 前言52-55
• 材料和方法55-66
• 1、材料55-57
• 2、实验方法57-66
• 实验结果66-84
• 1、乙型脑炎病毒E蛋白的表达66-73
• 2、乙型脑炎病毒E蛋白的纯化73-79
• 3、免疫攻击保护力实验79-80
• 4、血清中和抗体水平80-82
• 5、晶体结构解析82-84
• 讨论84-87
• 总结87-88
• 参考文献88-94
• 英文缩略词94-96
• 附录96-97
• 发表文章97-98
• 致谢98

【参考文献】

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1 侯爵;刘颖;邵一鸣;;黄热病毒的基因组及其蛋白研究进展[J];病毒学报;2011年04期

2 郭杨;陈世界;郭万柱;李t

本文编号：327105