CD81介导HCV入侵种属特异性分子基础研究

发布时间：2017-04-25 22:12

  本文关键词：CD81介导HCV入侵种属特异性分子基础研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：丙型肝炎病毒(HCV)感染是慢性肝病的主要诱因,在全世界范围内感染人数已超过1.7亿。由于HCV感染具有高度严格的宿主特异性,只有人和黑猩猩可支持HCV感染,HCV小动物模型的研发成为了阻滞HCV相关研究,特别是疫苗研发的瓶颈之一。HCV宿主特异性的基础来源于病毒入侵过程的复杂性。目前,已知HCV受体至少包括CD81, SR-B1, Claudin-1 和 Occludin等4种。其中CD81是HCV早期入侵所必须的。CD81直接与HCV-E2相结合,其介导HCV的入侵具有很强的种属特异性,只有人和黑猩猩的CD81以很高的亲和力结合HCV-E2并支持HCV入侵,但其分子机制至今尚不明确。为揭示CD81介导HCV入侵种属特异性分子机制,本课题利用结构生物学,生物物理学和病毒学的方法对人,小鼠,和非洲绿猴的,CD81 (hCD81, mCD81 和 agmCD81)进行了深入的研究。首先解析了hCD81-LEL, mCD81-LEL 和 agmCD81-LEL的高分辨率晶体结构,mCD81-LEL和agmCD81-LEL的全局结构与hCD81-LEL类似,均由五个α-螺旋组成“磨菇型”结构,螺旋-A/E构成了“磨菇茎”,螺旋-B/C/D构成了“蘑菇头”,其中D-helix是CD81直接与HCV-E2结合的区域。通过结构对比分析发现,在mCD81-LEL和agmCD81-LEL中188-196氨基酸残基之间形成了分子内氢键/盐键,而类似的分子内相互作用在hCD81-LEL中是不存在的。之前有研究报道,CD81D-helix构象的灵活性是与E2结合所必须的,而在mCD81-LEL 和 agmCD81-LEL结构中,分子内氢键或盐键通过把D-helix锚定在稳定的E-helix上,因此我们推测假分子内氢键/盐键对D-helix的构象灵活性产生了束缚作用,从而干扰了CD81与E2的相互作用,削弱了CD81介导HCV入侵效率。以往的研究表明F186是CD81与HCV-E2的结合所必须的,因此,我们在F186存在的基础上设计突变实验,验证188-196间氢键或盐键对E2结合以及HCV入侵效率的影响。结果表明,hCD81中,在F186存在的情况下,如果诱导188-196残基之间形成氢键/盐键,会削弱hCD81与HCV-E2之间的结合,同时会降低HCV的入侵效率。而对于mCD81 和 agmCD81,在具备L186F突变的前提下,破坏188-196残基之间的氢键/盐键,可以提升HCV的入侵效率。本课题结果证实,CD81中188-196间分子内氢键/盐键是决定其与HCV-E2的结合亲和力及其介导HCV入侵效率决定因素之一,此理论不但解释了CD81介导的HCV入侵种属特异性分子机制,同时为感染性动物模型的建立提供了筛选的理论依据。
【关键词】：HCV入侵 CD81 种属特异性 小动物模型
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R373
【目录】：

• 摘要6-7
• Abstract7-9
• 第1章 引言9-13
• 第2章 实验材料与方法13-41
• 1. 实验材料13-17
• 1.1 菌株13
• 1.2 质粒13-15
• 1.3 常用试剂和耗材15
• 1.4 常用溶液15-16
• 1.5 常用仪器和设备16-17
• 2. 实验方法17-41
• 2.1 基因的克隆与质粒构建17-22
• 2.1.1 引物设计18
• 2.1.2 目的基因的扩增18-19
• 2.1.3 PCR产物检测与回收19-20
• 2.1.4 目的基因与载体的限制性酶切20-21
• 2.1.5 目的基因与载体的连接21-22
• 2.1.6 连接产物转化22
• 2.1.7 克隆鉴定22
• 2.2 定点突变构建突变体22-27
• 2.2.1 突变体及引物设计23-26
• 2.2.2 PCR扩增26-27
• 2.2.3 消化27
• 2.2.4 转化27
• 2.3 目的蛋白表达与纯化27-30
• 2.3.1 蛋白表达条件筛选27-28
• 2.3.2 蛋白的大量表达纯化28-30
• 2.4 蛋白晶体筛选与优化30-32
• 2.4.1 蛋白晶体的初筛30-31
• 2.4.2 蛋白晶体的优化31-32
• 2.5 晶体数据收集及结构解析32-33
• 2.6 圆二色谱试验33-35
• 2.7 小角X射线散射试验35-37
• 2.8 结合试验37
• 2.9 病毒入侵试验37-41
• 2.9.1 构建CD81缺陷型Huh7.5.1细胞系38-39
• 2.9.2 扩增HCVpp和HCVcc病毒颗粒39
• 2.9.3 HCVpp感染试验39-40
• 2.9.4 HCVcc感染试验40-41
• 第3章 实验结果41-60
• 3.1 目的蛋白原核表达与纯化41-43
• 3.2 晶体初筛和优化43-45
• 3.2.1 结晶条件初筛结果43-44
• 3.2.2 结晶条件优化结果44-45
• 3.3 晶体解析及结构解析45-47
• 3.4 结构分析47-51
• 3.5 圆二色谱试验51-53
• 3.6 小角散射试验53-55
• 3.7 结合试验55-57
• 3.8 病毒入侵试验57-60
• 3.8.1 HCVpp入侵试验57-58
• 3.8.2 HCVcc入侵试验58-60
• 第4章 讨论60-64
• 参考文献64-68
• 致谢68-70
• 个人简历及发表文章70

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 冯炜玮;陈志伟;;蛋白质结晶及其影响因素研究进展[J];安徽农业科学;2010年18期

  本文关键词：CD81介导HCV入侵种属特异性分子基础研究，，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：327188