PTEN调节的ERK5信号对PC12细胞分化的影响

发布时间：2017-04-26 04:11

  本文关键词：PTEN调节的ERK5信号对PC12细胞分化的影响，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：背景神经细胞再生与分化障碍或退化涉及到许多疾病如老年痴呆、脊髓性肌肉萎缩、亨廷顿舞蹈症等,PTEN和MAPKs信号在细胞生长与分化过程中起着正负调节的作用,决定着生存与凋亡、生长与分化间的平衡。作为信号转导的调节因子,PTEN是一个重要的磷酸酶也是一个重要的肿瘤抑制因子。自从PTEN在1997年作为一个抑癌基因发现后,人们对其生物学活性进行了非常广泛的研究。已知PTEN的一个最重要的活性在于调节细胞内的生长与增殖信号,抑制过强信号导致的细胞恶性增生,在信号的正负平衡方面,起着负性调节作用.PTEN不仅对磷脂具有去磷酸化活性,使IP3去磷酸化生成PIP2,抑制PI3K/AK T信号通路的活性。而且对蛋白质也具有去磷酸化作用,已有研究分析表明,PTEN去磷酸化的底物氨基酸残基既包括丝氨酸和苏氨酸也包括酪氨酸。最早发现的PTEN蛋白质底物是FAK(focal adhesion kinase)。因而,PTEN又被称为双性磷酸酶。与PTEN对细胞生长的调节阴性调节相对应,MAPK家族在促进细胞生长方面属于阳性调控,在经典MAPK中,ERK5发现较晚、分子量相对较大,又称为BMK1,其由816个氨基酸构成,位于氨基末端近一半氨基酸残基构成了激酶结构域,其羧基末端包括两个脯氨酸富集区、一个核定位信号和一个近末端的自动磷酸化区域。ERK5信号途径受应激信号、生长因子和细胞因子信号激活。功能范围主要涉及细胞的生长、分化和调亡。ERK5受MEKK2/3-MEK5级联激活,激活后的ERK5转位到核内,直接激活其他转录因子。因此,PTEN在细胞内可能有着广泛的底物,可能直接或间接调节ERK5的活性。而PC12细胞是大鼠肾上腺嗜铬瘤细胞株,膜上有NGF受体,受生理水平NGF诱导后,它们停止分裂,长出突起,分化为具有交感神经元特性的细胞,常用于神经系统的体外研究。因此,通过本课题的研究,我们可能在PTEN对ERK5途径的各组分间对转录因子的调控中以及对神经细胞分化相关基因的表达调控中发现新的治疗靶位点,对临床应用具有很大的意义。目的通过比较确定PTEN作用于Cot/Tpl-MEKK2/3—MEK5—ERK5信号通路的切入点,即PTEN通过哪个分子的去磷酸化,下调这一信号通路的活性。而后,实验将进一步确定PTEN与靶目标分子间的作用,再利用免疫共沉淀、GST-pulldown重点分析PTEN与COT、PTEN与MEKK2/3、PTEN与MEK5、PTEN与ERK5间的相互作用,确定PTEN调节ERK5信号通路的切入点以及PTEN沉默后对PC12细胞分化的影响。方法利用免疫共沉淀重点分析PTEN与COT、PTEN与MEKK2/3、MEK5和ERK5间的相互作用,通过比较确定PTEN作用于Cot/Tpl—MEKK2/3—MEK5—ERK5信号通路的切入点;利用慢病毒稳定感染技术,通过免疫印记(Western-blot)验证并检测PTEN过表达后和沉默后,上、下游各信号分子磷酸化水平的变化,确定PTEN通过去磷酸化哪个分子来下调这一信号通路的活性;再通过体外实验,原核诱导表达GST-PTEN,然后GST-pulldown PC12细胞裂解液,验证PTEN作用的靶蛋白,以期确定PTEN调节Cot/Tpl—MEKK2/3—MEK5—ERK5信号通路对PC12细胞分化的影响;此外,利用Ray Bio人类RTK磷酸化抗体芯片,检测PTEN过表达和沉默后受体酪氨酸激酶信号通路各因子的相对磷酸化水平,检测PTEN可能作用的靶蛋白受体,探索可能受PTEN去磷酸化调控的与细胞分化相关的其他信号通路分子。结果在获得PTEN稳定过表达和沉默的HEK 293T细胞系后,通过Western-blot、免疫共沉淀及GST-pulldown发现,PTEN沉默后,MEK5和ERK5的磷酸化水平增加,且PTEN能与MEK5、ERK5相互作用;通过计数得到的细胞生长曲线,发现是PTEN沉默后HEK 293T细胞生长速度比PTEN过表达的细胞生长速度快;通过培养PTEN沉默的PC12细胞后发现相对于正常的PC12突起生长显著;通过Ray Biotech人类受体酪氨酸激酶磷酸化抗体芯片1检测,发现PTEN沉默后,与PTEN沉默对照组相比,有四个因子Eph B3、HGFR、MUSK、VEGFR2磷酸化水平上调,PTEN沉默后与PTEN过表达相比,有两个因子Insulin R和VEGFR2的表达水平明显上调。结论1.PTEN通过作用于MEK5间接调节ERK5活性,并同时直接作用于ERK5调节Cot/Tpl-MEKK2/3-MEK5-ERK5信号通路;2.PTEN沉默后,能够促进HEK 293T细胞的增殖;3.PTEN沉默的PC12细胞相对于正常组PC12突起生长显著;4.Eph B3、HGFR、MUSK、VEGFR2、Insulin R和VEGFR2等受体因子可能是PTEN去磷酸化的靶蛋白受体,这还有待于进一步证实。
【关键词】：PTEN 信号通路 ERK5 细胞分化
【学位授予单位】：河南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R3416
【目录】：

• 摘要4-7
• ABSTRACT7-13
• 英文缩略词表13-15
• 前言15-19
• 1.材料19-25
• 1.1 主要材料试剂19-20
• 1.2 试剂配制20-23
• 1.3 仪器设备23-25
• 2.实验方法25-39
• 2.1 细胞培养实验25-26
• 2.1.1 细胞生长条件25
• 2.1.2 细胞复苏25
• 2.1.3 细胞传代25
• 2.1.4 细胞冻存25-26
• 2.2 细胞中总RNA的提取及定量26
• 2.3 反转录PCR合成CDNA第一链26-27
• 2.4 TOP10感受态细胞的制备27
• 2.5 PTEN-PCDNA3.1(-)质粒和PTEN-PGEX-6P-1 质粒的构建27-31
• 2.5.1 引物设计及目的基因CDS区扩增27-28
• 2.5.2 胶回收目的基因28-29
• 2.5.3 目的基因两端加A29
• 2.5.4 连接pGEM-T easy Vector29
• 2.5.5 转化Top10感受态进行蓝白班筛选29
• 2.5.6 质粒的提取29-30
• 2.5.7 酶切鉴定及测序正确后亚克隆至目的载体pcDNA3.1(-) 和载体pGEX-6p-1.1630-31
• 2.6 慢病毒实验31-32
• 2.6.1 送公司包装PTEN过表达和干扰慢病毒31
• 2.6.2 慢病毒滴度检测实验31
• 2.6.3 慢病毒感染实验31-32
• 2.7 测定细胞生长曲线32
• 2.8 人RTK磷酸化抗体芯片检测32
• 2.9 血清刺激实验32
• 2.10 WESTERN-BLOT32-35
• 2.10.1 蛋白样品的收集32-33
• 2.10.2 BCA法测蛋白浓度33
• 2.10.3 Western-blot实验33-35
• 2.11免疫共沉淀实验35
• 2.12 GST-PULLDOWN验证PTEN与MEK5、ERK5的结合35-39
• 3.实验结果39-53
• 3.1 PTEN-PGEX-6P-1 原核表达质粒和PTEN-PCDNA3.1(-)过表达质粒构建结果39-40
• 3.2 慢病毒感染实验结果40-41
• 3.3 细胞生长曲线实验结果41-42
• 3.4 PTEN过表达和沉默后ERK5上游各因子磷酸化水平的检测42-43
• 3.5 免疫共沉淀实验结果43-44
• 3.6 PTEN去磷酸化作用WESTERN-BLOT检测实验44-46
• 3.7 GST-PTEN优化诱导表达及纯化实验结果46-48
• 3.8 GST-pulldown 实验结果48-49
• 3.9 人RTK磷酸化抗体芯片检测实验结果49-53
• 4.讨论53-57
• 5.结论57-59
• 参考文献59-63
• 综述63-79
• 参考文献72-79
• 致谢79-81
• 攻读硕士期间发表的论文81-82

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