计算分析疱疹病毒感染引起宿主基因转录组和表观遗传组的改变

发布时间：2017-04-26 12:08

  本文关键词：计算分析疱疹病毒感染引起宿主基因转录组和表观遗传组的改变，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：Ⅰ型单纯疱疹病毒(Herpes Simplex Virus type I,HSV-1)是一种双链线性DNA病毒,基因组全长152kb,可以编码80个蛋白基因,超过80%的人被HSV-1感染。HSV-1从外周神经节感觉神经元进入潜伏期感染。应急信号可以引起HSV-1在感觉神经元重激活,裂解感染确保表皮细胞神经元活化,最终造成唇疱疹,脑膜炎,甚至导致死亡。HSV-1裂解期感染是快速展开,即早期基因(immediate early,IE)的表达,包括ICP0和ICP4,这些基因的表达可以立即招募宿主的RNA聚合酶和其他的转录调控因子,从而促使HSV-1病毒的早期基因的表达,准备开始病毒DNA的合成和晚期基因的表达,而晚期基因是在病毒感染6小时后才开始表达的。在以上所提及的生物过程中,病毒可以利用宿主的调控因子,宿主的反应和途径来促进病毒的复制。宿主细胞遭到病毒的入侵后,可以引起许多宿主反应,比如激活干扰素途径,DNA损伤反应,凋亡和其他的抑制病毒增长的机制。而病毒基因自身编码的蛋白因子可以抵抗以上所说的宿主反应,从而确保病毒可以顺利地转录,基因组合成和组装。比如ICP34.5是干扰INF-β途径的关键性的病毒因子；ICP27和ICP22是宿主凋亡反应的调控因子,通过失活ATR激酶来抑制DNA损伤反应；ICP0通过在DNA损伤反应中替换宿主沉默复合物CoREST以及降解RNF8和RNF168,从而抑制宿主转录沉默活性；HSV-1也编码ICP27来抑制RNA可变剪接和VHS降解宿主RNAs。尽管已经有这些研究进展,但是病毒与宿主之间的表观遗传相互作用依然不是完全了解。HSV-1在人类表皮细胞进行裂解期感染并且剧烈的改变宿主细胞核。以前的DNA芯片分析感染的小鼠角膜和小鼠胚胎成纤维细胞(MEF),揭示广泛的宿主基因表达谱的改变。在这里我们通过高通量测序RNA-seq,分析了HSV-1感染人类表皮纤维BJ细胞的RNA-seq,发现差异基因表达,可变剪接,可变加尾和基因变体变化。与对照组相比,HSV-1感染后引起978个上调基因和61个下调基因,同时造成217个可变剪接,161个可变加尾和1827个基因异构体。结果表明,我们发现超过700个基因的基因异构体发生变化。有意思的是,GO分析揭示,参与神经元生成的基因在病毒感染后显著上调,而在可变剪接,可变加尾和基因异构体方面没有任何变化,表明可能是由于ICP0的去抑制,造成神经元基因显著上调。我们找到了许多病毒与宿主相互作用的重要基因,比如转录调控因子brd2和cbx4。我们还发现了108个基因参与RNA代谢,包括选择性降解ARE元件细胞因子zfp36。分析结果揭示了许多新的参与病毒与宿主相互作用的基因,并且暗示可变剪接和可变加尾作为重要的机制,在病毒感染的细胞中产生新的调控功能。有趣的是,病毒感染引起宿主染色质急剧动态重组,比如在全基因组中,将近90%的CTCF在病毒感染后缺失。高度诱导的基因倾向与CTCF相互作用,表明CTCF可能在高度调控的基因发挥重要的作用。RNA-seq和RNA Pol II ChIP-seq相比较,我们发现130个基因在转录水平被诱导,而444个是在RNA代谢水平被调控。总之,通过结合RNA-seq, ChIP-seq,经典的病毒学和基因组学研究,我们能够揭示HSV-1感染人类表皮细胞后转录组和表观遗传组的重大变化。这些分析给细胞基因组如何应对急性外部感染,比如裂解期病毒感染,和在基因组水平展开的病毒与宿主之间的表观遗传作用新的启示。
【关键词】：I型单纯疱疹病毒 基因差异表达 可变剪接 可变加尾 异构体
【学位授予单位】：安徽大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R373.11
【目录】：

• 摘要3-5
• Abstract5-10
• 第一章 引言10-19
• 1 HSV-1介绍10-12
• 1.1 HSV-1危害10
• 1.2 HSV-1目前研究进展10-11
• 1.3 本课题研究目标11
• 1.4 本课题科学价值和临床应用价值11-12
• 2 RNA-sequencing12-14
• 2.1 RNA-sequencing测序技术方法12
• 2.2 RNA-sequencing优势与难点12-13
• 2.3 RNA-sequenc数据分析一般方法13-14
• 3 ChIP-sequencing14-16
• 3.1 ChIP-sequencing测序技术方法14
• 3.2 ChIP-sequencing优势与难点14
• 3.3 ChIP-sequenc数据分析一般方法14-16
• 4 CTCF16-19
• 4.1 CTCF介绍16
• 4.2 CTCF生物功能16-19
• 第二章 HSV-1诱导基因差异表达,可变剪接,可变加尾和异构体表达19-50
• 1 课题的设计19
• 2 RNA-seq技术路线19-20
• 3 材料与方法20-31
• 3.1 主要仪器20
• 3.2 试剂与耗材20-21
• 3.3 主要溶液及其配置21
• 3.4 细胞与病毒21-22
• 3.4.1 细胞与病毒的来源21
• 3.4.2 病毒的扩增21-22
• 3.4.3 病毒滴度测定22
• 3.5 RNA-seq测序样品准备22-25
• 3.5.1 BJ细胞培养22-23
• 3.5.2 HSV-1感染BJ细胞23
• 3.5.3 免疫荧光检测病毒感染效果23-24
• 3.5.4 RNA提取24-25
• 3.6 RNA-seq数据分析25-26
• 3.6.1 基因差异表达数据分析25
• 3.6.2 基因可变剪接数据分析25
• 3.6.3 基因可变加尾数据分析25
• 3.6.4 基因异构体数据分析25-26
• 3.7 实时荧光定量PCR和实时定量PCR26-31
• 3.7.1 cDNA合成(用于qRT-PCR)26
• 3.7.2 cDNA合成(用于半定量PCR)26-27
• 3.7.3 引物设计和合成27-30
• 3.7.4 荧光定量PCR验证30-31
• 3.7.5 半定量PCR验证31
• 4 实验结果31-47
• 4.1 HSV-1感染宿主细胞BJ诱导基因差异表达32-36
• 4.2 HSV-1感染BJ细胞导致可变剪接36-39
• 4.3 HSV-1感染BJ细胞导致可变加尾39-42
• 4.4 HSV-1感染BJ细胞Isoform表达42-44
• 4.5 差异表达,可变剪接,可变加尾和异构体的GO terms变化产生不同的调控机制44-47
• 5 结论47-50
• 第三章 HSV-1改变CTCF和RNA PolⅡ结合50-62
• 1 课题的设计50
• 2 ChIP-seq技术路线50-51
• 3 材料与方法51-55
• 3.1 主要仪器51
• 3.2 试剂51
• 3.3 主要溶液及其配置51-53
• 3.4 ChIP-seq测序样品准备53-55
• 3.5 ChIP-seq数据分析55
• 4 实验结果55-60
• 4.1 CTCF结合变化56
• 4.2 CTCF与基因表达之间的关系56-58
• 4.3 HSV-1感染前后RNA polⅡ与RNA-seq关系58-60
• 5 结论60-62
• 参考文献62-74
• 附录74-75
• 致谢75

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本文编号：328406