肺炎克雷伯菌裂解性噬菌体的分离和鉴定

发布时间：2017-04-29 00:06

  本文关键词：肺炎克雷伯菌裂解性噬菌体的分离和鉴定，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）属肠杆菌科细菌、革兰染色阴性杆菌，是引起医院内感染的病原菌之。肺炎克雷伯菌引起的侵袭性感染可导致器官（如肾脏、脾脏、大脑和前列腺）和组织的脓肿，特别是近年来，由肺炎克雷伯菌引起的社区获得性(community-acquired)的化脓性肝脓肿有增加的趋势。此外，，携带编码超广谱β-内酰胺酶（extended-spectrumbeta-lactamases, ESBLs）质粒的多重耐药肺炎克雷伯菌所致医院内感染的报告也逐年上升。多重耐药细菌的不断出现方面导致抗生素疗效的下降，另方面亦大大增加了耐药性细菌在病人体内定植的可能性。噬菌体是种可以特异性裂解细菌的病毒，广泛存在于自然界。利用噬菌体治疗细菌性感染，称为噬菌体疗法。本论文目的是分离裂解性肺炎克雷伯菌噬菌体并分析生物学特性，为噬菌体用于耐药性肺炎克雷伯菌的感染提供初步的前期工作。 本项研究以25株肺炎克雷伯菌临床分离株为宿主菌，从医院污水中分离出4株裂解性肺炎克雷伯菌噬菌体(分别命名为φKp-lyy15、φKp-lyy17、φKp-lyy19和φKp-lyy22)。透射电镜观察显示，4株噬菌体的形态学特征符合有尾病毒目(theCaudovirales)，其中噬菌体φKp-lyy15和φKp-lyy19为长尾病毒科(Siphoviridaefamily)噬菌体；噬菌体φKp-lyy17属于足尾病毒科(Podoviridae family)噬菌体；而噬菌体φKp-lyy22则属于滴状病毒科(Guttaviridae family)噬菌体。通过生物学特性的分析发现，(1)噬菌体φKp-lyy22的潜伏期为15min、爆发期的时间近80min，爆发量为60PFU/cell。此外，φKp-lyy22仅能裂解3株肺炎克雷伯菌分离株（裂解率为12%），说明裂解谱较窄；(2)噬菌体φKp-lyy15的潜伏期为10min、爆发期的时间为30min，爆发量为65PFU/cell；(3) φKp-lyy15的基因组为dsDNA、含有EcoR V、Nde I和Bgl II的酶切位点；(4) φKp-lyy15的SDS-PAGE分析，可见3个主要蛋白条带和8个次要蛋白条带，其相对分子量在15～170kDa之间；(5)噬菌体φKp-lyy15可裂解8株肺炎克雷伯菌分离株（裂解率为32%），说明具有较宽的裂解谱；(6)稳定性试验显示，噬菌体φKp-lyy15在pH4～10的范围内以及在50℃～60℃的条件下仍可有效裂解宿主菌。 综上所述，1.本项工作分离的4株肺炎克雷伯菌噬菌体为裂解性噬菌体，噬菌体φKp-lyy15和φKp-lyy19属有尾病毒目、长尾病毒科噬菌体；噬菌体φKp-lyy17和φKp-lyy22则分别属于足尾病毒科和滴状病毒科噬菌体。2.通过生物学特性的分析发现，噬菌体φKp-lyy15是潜伏期短、裂解性强、裂解谱宽以及对pH和温度具有耐受性的裂解性噬菌体，为进步研究利用噬菌体治疗耐药性肺炎克雷伯菌感染提供了可能。
【关键词】：噬菌体 噬菌体治疗 肺炎克雷伯菌 多重耐药性
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R378
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-11
• 中英文缩略词对照11-12
• 第1章 文献回顾12-18
• 1.1 肺炎克雷伯菌所致的感染和耐药监测近况12-13
• 1.2 噬菌体疗法及其针对肺炎克雷伯菌感染的治疗13-16
• 1.3 噬菌体的应用16-18
• 第2章 肺炎克雷伯菌噬菌体的分离鉴定及生物学特性研究18-41
• 2.1 材料18-21
• 2.1.1 菌株18-19
• 2.1.2 主要试剂19-20
• 2.1.3 主要仪器20-21
• 2.2 方法21-26
• 2.2.1 宿主菌的准备21
• 2.2.2 污水样本处理21
• 2.2.3 噬菌体的分离21
• 2.2.4 噬菌体的初步纯化和滴度测定21-22
• 2.2.5 宿主菌的裂解谱试验22
• 2.2.6 噬菌体透射电镜观察22
• 2.2.7 噬菌体核酸提取22-23
• 2.2.8 噬菌体核酸酶切分析23
• 2.2.9 细菌总数测定实验23
• 2.2.10 噬菌体最佳感染复数( Multiplicity of infection，MOI) 的测定23-24
• 2.2.11 噬菌体吸收率实验24
• 2.2.12 噬菌体一步生长曲线的测定24-25
• 2.2.13 噬菌体热稳定性试验25
• 2.2.14 噬菌体 pH 稳定性试验25
• 2.2.15 噬菌体蛋白 SDS-PAGE 分析25-26
• 2.3 结果26-38
• 2.3.1 肺炎克雷伯菌的形态26-27
• 2.3.2 噬菌体的分离27-28
• 2.3.3 噬菌体的初步纯化28
• 2.3.4 噬菌体裂解谱试验28-30
• 2.3.5 噬菌体电镜观察结果30-31
• 2.3.6 噬菌体基因组的酶切电泳31-32
• 2.3.7 噬菌体φKp-lyy15 的 MOI 测定32-33
• 2.3.8 噬菌体的吸收率实验33-34
• 2.3.9 噬菌体的一步生长曲线实验34-35
• 2.3.10 噬菌体的热稳定性35-36
• 2.3.11 噬菌体的 pH 稳定性36-37
• 2.3.12 噬菌体蛋白的 SDS-PAGE 电泳37-38
• 2.4 讨论38-41
• 第3章 结论41-42
• 参考文献42-49
• 作者简介49-50
• 在校期间科研成果50-51
• 致谢51

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前9条

1 张雪云;褚云卓;欧阳金鸣;陈佰义;;耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌耐药机制研究[J];中国感染与化疗杂志;2007年06期

2 王公德;参与金属腐蚀的微生物及其控制[J];生物学通报;1996年02期

3 李继霞;公衍文;;多重耐药菌医院感染状况分析[J];检验医学;2013年09期

4 刘子芝;赵勇;刘纪艳;杨建华;尹望中;王颖;赵晶;周永q

本文编号：333801