脑膜炎大肠杆菌的IbeA诱导多形核细粒细胞穿越血脑屏障的研究

发布时间：2021-08-13 04:36

　　多核中性粒细胞（PMN）跨越血脑屏障是细菌性脑膜炎病原发生中的一个关键事件。跨过血脑屏障的迁移-PMN向中枢神经系统的募集是一把“双刃剑”，它不仅是宿主防御系统对抗脑膜炎性细菌病原菌的关键环节，它也会带来显著的中枢神经系统组织损伤；后者导致灾难性的神经系统后遗症。尽管目前疫苗的研发可以降低细菌的感染率，但仍不能完全解除脑膜炎的危害。脑膜炎病理机制方面的研究发现，致病性的脑膜炎性大肠杆菌K1菌株所独有的IbeA蛋白是一个50KDa的膜蛋白,是位于该菌染色体第98分钟处的基因岛-GimA中的一个独特基因所编码的；IbeA作为一侵袭因子，能够诱导大肠杆菌侵入到脑内皮微血管细胞（BMEC）；而正是脑内皮微血管细胞组成了血脑屏障。然而，对于IbeA在PMN跨血脑屏障过程中的作用尚未见报道；本文探索了IbeA在PMN跨血脑屏障迁移中的作用。通过建立的体外与体内实验模型，分别对ibeA缺失突变体（ZD1）、IbeA蛋白或ibeA基因回补突变体、IbeA蛋白包被的微珠、母本菌株（E44）在人BMEC和大肠杆菌性脑膜炎的小鼠模型中检验了它们对PMN跨内皮迁移至中枢神经系统的诱导能力。ibeA基因缺失突变... 

【文章来源】：华南理工大学广东省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：121 页

【学位级别】：博士

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摘要
Abstract
英文缩略词表
第一章 绪论
    1.1 新生儿细菌性脑膜炎的研究进展
        1.1.1 病理生理学特征
        1.1.2 细菌性脑膜炎病理机制的研究进展
    1.2 多核白细胞跨内皮迁移的研究进展
        1.2.1 细胞跨内皮迁移研究的概述
        1.2.2 细胞跨内皮迁移与一些疾病的发生及发展的关系
        1.2.3 细胞跨内皮迁移的方式
        1.2.4 细胞跨内皮迁移的机制
        1.2.5 白细胞跨内皮迁移的研究进展
    1.3 中间纤维波形蛋白的结构和功能
        1.3.1 中间纤维蛋白概述
        1.3.2 波形蛋白和神经胶质酸性蛋白
        1.3.3 波形蛋白的功能和作用
    1.4 脂阀及其在脑膜炎性大肠杆菌引起的白细胞迁移中的作用
        1.4.1 脂阀概述
        1.4.2 脂筏与细菌相互作用
        1.4.3 脂筏与细菌毒素
        1.4.4 脂筏参与病毒入胞过程
    1.5 立题依据和主要研究内容
        1.5.1 立题依据
        1.5.2 主要研究内容
第二章 IbeA 在脑膜炎性细菌引起的 PMN 迁移中的作用
    2.1 材料与方法
        2.1.1 菌种和细胞及主要试剂
        2.1.2 实验器材和实验耗材
        2.1.3 细菌培养
        2.1.4 细胞培养
        2.1.5 多核白细胞跨内皮迁移的体外实验
        2.1.6 感受态细胞制备和电转化
        2.1.7 His-IbeA 蛋白的表达与纯化
        2.1.8 ibeA 基因在脑膜炎性大肠杆菌引起的白细胞跨越血脑屏障的体内动物实验
        2.1.9 IbeA 包被的 beads 及大肠杆菌之间的相互作用
    2.2 结果与分析
        2.2.1 大肠杆菌 K1 菌株引起的 PMN 与 BMEC 的相互作用
        2.2.2 纯化的 IbeA 蛋白引起的 PMN 与 BMEC 的相互作用
        2.2.3 IbeA 蛋白足以诱导体外的 PMN 跨脑部微血管内皮细胞迁移
        2.2.4 IbeA 蛋白诱导体内的 PMN 跨脑内皮迁移现象
        2.2.5 条件培养基对 PMN 跨内皮迁移的效应
    2.3 本章小结
第三章 波形蛋白在脑膜炎性大肠杆菌 K1 菌株引起多核白细胞跨内皮迁移中的作用
    3.1 材料与方法
        3.1.1 菌种、细胞及主要试剂
        3.1.2 实验仪器与耗材
        3.1.3 大肠杆菌菌株
        3.1.4 Western Blotting 杂交
        3.1.5 PMN 迁移体外实验
        3.1.6 Lentivirus 慢病毒转染人 BMECs
        3.1.7 人 BMEC 中慢病毒介导的波形蛋白过表达
        3.1.8 免疫荧光与共聚焦显微分析
    3.2 结果与分析
        3.2.1 波形蛋白断裂抑制了 IbeA 诱导的 PMN 跨内皮迁移
        3.2.2 BMEC 波形蛋白过量表达对 PMN 穿脑内皮迁移的效应
        3.2.3 PMN 通过 BMEC 的跨细胞迁移是由波形蛋白介导的
    3.3 本章小结
第四章 脑膜炎性大肠杆菌诱导多核白细胞跨 BMEC 迁移的路径探索
    4.1 材料与方法
        4.1.1 菌种、细胞及主要试剂
        4.1.2 实验仪器与耗材
        4.1.3 大肠杆菌菌株
        4.1.4 Western Blotting 杂交
        4.1.5 内皮细胞粘附分子表达的免疫印迹分析
        4.1.6 人 BMEC 中慢病毒介导的波形蛋白过表达与头部区域缺失表达
        4.1.7 PMN 体外迁移实验
        4.1.8 免疫荧光观察与数据统计
    4.2 结果与分析
        4.2.1 脑膜炎性大肠杆菌诱导内皮细胞粘附分子表达
        4.2.2 IbeA 蛋白诱导内皮细胞粘附分子表达
        4.2.3 BMEC 波形蛋白对内皮细胞上粘附分子表达的效应
        4.2.4 脂阀在 ibeA+的大肠杆菌诱导的 PMN 跨 BMEC 迁移中的作用
    4.3 本章小结
第五章 IbeA 蛋白引起白细胞迁移的功能性片段初步鉴定
    5.1 材料与方法
        5.1.1 菌种与细胞
        5.1.2 质粒与载体
        5.1.3 工具酶及主要试剂
        5.1.4 实验仪器与耗材
        5.1.5 原核表达载体的构建
        5.1.6 融合蛋白的诱导表达与纯化
    5.2 结果与分析
        5.2.1 IbeA 蛋白的生物信息学分析
        5.2.2 PCR 目的片段扩增
        5.2.3 融合蛋白的诱导表达与纯化
        5.2.4 IbeA 片段蛋白的功能鉴定
    5.3 本章小结
结论与展望
    结论
    论文创新之处
    展望
参考文献
攻读博士学位期间取得的研究成果
致谢
答辩委员会对论文的评定意见



本文编号：3339757