基孔肯雅病毒核酸检测方法建立和结构蛋白E2单克隆抗体的制备及鉴定

发布时间：2021-08-15 11:53

　　基孔肯雅病毒（Chikungunya virus,CHIKV）是包被囊膜的单股正链RNA病毒,是披膜病毒科（Togaviridae）甲病毒属（Alphavirus）中的一员,蚊虫叮咬是其主要传播途径,人被感染后会引起发热、头痛、斑丘疹及全身性关节炎等症状,极少数患者可能会出现脑膜炎、心肌炎、肝功能损伤及皮肤黏膜出血,给人类生命健康带来极大威胁。随着全球气候变暖,各国交流日加频繁,此病毒的传播范围也在随之扩大。2008年,我国发现首例CHIKV的输入性病例,之后每年都有输入性病例报道。我国分布有可传染CHIKV的蚊虫种类,因此存在大范围爆发的可能性。然而,目前对此病毒的研究并不透彻,尚无有效的预防和治疗手段,所以前期对于病毒的检测诊断显得尤为重要。本文针对CHIKV检测诊断方法的建立做了以下两部分工作:（1）CHIKV和寨卡病毒（Zika virus,ZIKV）双重荧光定量RT-PCR方法的建立;（2）针对CHIKV结构蛋白E2单克隆抗体的制备与鉴定。（1）CHIKV和ZIKV双重荧光定量RT-PCR方法的建立由于CHIKV和ZIKV在发病初期的症状十分相似（发热,头痛,全身肌肉痛等）,... 

【文章来源】：中国科学院大学(中国科学院武汉病毒研究所)湖北省

【文章页数】：88 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
abstract
第1章 前言
    1.1 基孔肯雅病毒概述
        1.1.1 基孔肯雅病毒分类
        1.1.2 基孔肯雅病毒的流行病学和病原特征
        1.1.3 基孔肯雅病毒粒子形态结构
        1.1.4 基孔肯雅病毒的基因组结构特点及生命周期
        1.1.5 基孔肯雅病毒的结构蛋白功能
        1.1.6 基孔肯雅病毒非结构蛋白的功能
        1.1.7 基孔肯雅病毒诊断检测方法
        1.1.8 基孔肯雅病毒疫苗研制及治疗策略
        1.1.9 单克隆抗体概述及应用
    1.2 本研究的目的和意义
        1.2.1 基孔肯雅病毒和寨卡病毒双重荧光定量RT-PCR研究的意义
        1.2.2 基孔肯雅病毒结构蛋白E2单克隆抗体的制备意义
第2章 基孔肯雅病毒和寨卡病毒双重荧光定量RT-PCR建立
    2.1 实验材料
        2.1.1 实验仪器
        2.1.2 细胞系、病毒
        2.1.3 化学试剂和试剂盒
    2.2 实验方法
        2.2.1 基孔肯雅病毒和寨卡病毒病毒RNA提取
        2.2.2 基孔肯雅病毒和寨卡病毒感染细胞总RNA提取
        2.2.3 双重实时荧光定量RT-PCR引物和探针的设计
        2.2.4 双重实时荧光定量RT-PCR体系的配制
        2.2.5 双重实时荧光定量RT-PCR标准曲线建立
        2.2.6 双重实时荧光定量RT-PCR法灵敏度和特异性检测
        2.2.7 双重实时荧光定量RT-PCR法检测不同株的CHIKV和ZIKV
        2.2.8 双重实时荧光定量RT-PCR法检测ZIKV生长曲线
        2.2.9 双重实时荧光定量RT-PCR法检测临床样本
    2.3 实验结果
        2.3.1 双重实时荧光定量RT-PCR标准曲线
        2.3.2 双重实时荧光定量RT-PCR灵敏度检测
        2.3.3 双重实时荧光定量RT-PCR特异性检测
        2.3.4 双重实时荧光定量RT-PCR检测不同毒株的CHIKV和ZIKV
        2.3.5 双重实时荧光定量RT-PCR检测临床样本
        2.3.6 双重荧光定量RT-PCR检测寨卡病毒(ZIKV)生长曲线
    2.4 讨论
第3章 基孔肯雅病毒结构蛋白E2单克隆抗体制备及鉴定
    3.1 实验材料
        3.1.1 仪器及设备
        3.1.2 材料菌株、细胞、病毒、小鼠
        3.1.3 质粒、酶、器材
        3.1.4 试剂盒及相关试剂
    3.2 实验方法
        3.2.1 基孔肯雅病毒结构蛋白E2的表达纯化
        3.2.2 基孔肯雅病毒E2蛋白原核表达
        3.2.3 基孔肯雅病毒E2蛋白纯化
        3.2.4 单克隆抗体的制备和鉴定
    3.3 实验结果
        3.3.1 基孔肯雅病毒E2蛋白原核表达质粒构建
        3.3.2 基孔肯雅病毒E2蛋白原核表达纯化
        3.3.3 目的蛋白割胶纯化
        3.3.4 ELISA筛选方法的建立
        3.3.5 免疫后鼠源多抗效价测定及验证
        3.3.6 间接ELISA初筛阳性杂交瘤细胞
        3.3.7 阳性杂交瘤细胞系的IFA检测
        3.3.8 阳性杂交瘤细胞系的Westernblot检测
        3.3.9 其他性质鉴定
        3.3.10 阳性杂交瘤细胞系的表位鉴定
        3.3.11 阳性杂交瘤细胞系的中和活性检测
        3.3.12 腹水抗体制备、纯化及SDS-PAGE检测
        3.3.13 腹水纯化抗体的IFA检测
        3.3.14 腹水纯化抗体的Westernblot检测
        3.3.15 腹水纯化抗体特异性鉴定
        3.3.16 腹水纯化抗体中和活性检测
        3.3.17 腹水纯化抗体效价检测
    3.4 讨论
第4章 总结与展望
    4.1 总结
    4.2 展望
参考文献
附录A 常用缩写
附录B 常用试剂配方
致谢
作者简历



本文编号：3344505