基孔肯雅病毒nsP1蛋白棕榈酰化的研究

发布时间：2021-09-01 10:06

　　棕榈酰化是蛋白质翻译后脂类修饰的重要形式,通过调控蛋白质的转运、稳定性和定位来影响蛋白的功能,S棕榈酰化是一种较常见的棕榈酰化形式。基孔肯雅病毒属于披膜病毒科甲病毒属,是一种单股正链RNA病毒。本论文中我们利用蛋白棕榈酰化预测软件对基孔肯雅病毒nsP1的S棕榈酰化位点进行预测,发现其S棕榈酰化位点位于C417-419。我们分别构建了这一区域的单点突变和三点突变的质粒,通过棕榈酰化实验发现这三个位点是nsP1蛋白S棕榈酰化的关键位点。已有研究表明,脂肪酸合成酶抑制剂能抑制基孔肯雅病毒复制,但其机制还不清楚。我们发现脂肪酸合成酶的重要产物——棕榈酸能够拯救脂肪酸合成酶抑制剂对病毒复制的抑制作用,该结果暗示,脂肪酸合成酶抑制剂对病毒的抑制可能是因为nsP1蛋白的S棕榈酰化受到影响。蛋白的S棕榈酰化主要是由具有锌指D-H-H-C结构域的棕榈酰化转移酶（zinc-finger D-H-H-C domain containing-palmitoyltransferase,ZDHHC）所介导的,而基孔肯雅病毒的nsP1是由哪个棕榈酰化转移酶所催化还不清楚。在本研究中,我们试图筛选影响基孔肯雅病毒ns... 

【文章来源】：北京协和医学院北京市 211工程院校 985工程院校

【文章页数】：73 页

【学位级别】：硕士

【部分图文】：

图２．?ｎｓＰｌ蛋白分区??Ｆｉｇｕｒｅ?２．?Ａｌｐｈａｖｉｒｕｓ?ｎｓＰｌ?ｐｒｏｔｅｉｎ?ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ??

?硕士学位论文???三、实验结果??３．１基孔肯雅病毒的制备??制备基孔肯雅病毒的质粒ｐＳｉｎＲｅｐ５－１８１／２５ｉｃ是从ａｄｄｇｅｎｅ购得，该基因是基孔??肯雅病毒疫苗株，因此，病毒可在Ｐ２实验室进行操作。首先，我们将该质粒线性??化，所选酶切位点是Ｎｏｔｌ，然后进行体外转录，得到病毒ＲＮＡ，然后电击到细胞??中，保险起见，我们电击到两种细胞中——ＨｅＬａ和Ｈｕｈ７．５．１细胞，收集上清中的??病毒，测病毒滴度，用于接下来的病毒实验。图３是用得到的病毒上清侵染ＨｅＬａ??细胞后ｗｅｓｔｅｒｎ?ｂｌｏｔ和免疫荧光检测病毒侵染情况，我们通过检测ｎｓＰｌ判断是否产??生病毒。??

将细胞裂解，进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ凝胶电泳，ｗｅｓｔｅｒｎ?ｂｌｏｔ分析，检测脂肪酸??合成酶和ｎｓＰｌ蛋白的表达，ａｃｔｉｎ作为内参蛋白。从图中可以看出，在基孔肯雅病??毒侵染后，脂肪酸合成酶蛋白的表达量有所提高（图７Ｂ）。??■ＨＯＢ??ＣＨＩＫＶ?－?＋??ＦＡＳＮ?一??ｎｓＰ１?＾??Ａｃｔ?ｉｎ?？着??图７．基孔肯雅病毒侵染后脂肪酸合成酶表达上调??Ｆｉｇｕｒｅ?７．?ＣＨＩＫＶ?ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ?ｉｎｄｕｃｅｓ?ＦＡＳＮ?ｕｐ－ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ??Ａ．将ＨｅＬａ细胞铺到小玻片上，基孔肯雅病毒侵染或不侵染，８小时后使用４％ＰＦＡ固定细胞，??封闭液封闭后用ａｎｔｉ－ＦＡＳＮ、ａｎｔｉ－ｄｓＲＮＡ进行染色，细胞核用ＤＡＰＩ染色，用激光共聚焦显微镜??检测病毒侵染前后脂肪酸合成酶在细胞内的表达情况。Ｂ．基孔肯雅病毒（ＭＯＩ＝ｌ）侵染或不侵??染ＨｅＬａ细胞，８小时后，去掉上清，ＰＢＳ洗３次，每孔加入６〇４的裂解液，各取２〇４裂解液??进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ凝胶电泳，通过ｗｅｓｔｅｒｎ?ｂｌｏｔ方法使用ａｎｔｉ－ｎｓＰｌ抗体和ａｎｔｉ－ＦＡＳＮ抗体检测病??毒蛋白以及脂肪酸合成合成酶的表达情况

【参考文献】：
期刊论文
[1]Interplay between hepatitis C virus and ARF4[J]. Na Zhang,Youyang Ke,Leiliang Zhang.  Virologica Sinica. 2017(06)



本文编号：3376786