利用CRISPR/Cas9技术构建ApoE -/- 猪模型

发布时间：2021-10-19 19:00

　　研究背景：心脑血管疾病是全世界主要的致死性疾病,动脉粥样硬化是其重要的病理基础。高脂血症和高胆固醇血症被认为是动脉粥样硬化发病及发展的重要因素。载脂蛋白E（ApoE）在胆固醇和脂蛋白的转运和代谢中发挥重要作用。ApoE基因敲除小鼠的广泛应用,使得动脉粥样硬化早期病理机制的研究取得了很大进展。但ApoE敲除小鼠与人类在动脉粥样硬化病理机制上相去甚远。猪因为在解剖学和生理上和人类似,适合于建立动脉粥样硬化大动物模型。目的：通过敲除猪的ApoE基因,建立国际上首批ApoE基因敲除猪,培育动脉粥样硬化的猪模型,能更好地研究动脉粥样硬化的发病机理,同时为进一步研究动脉粥样硬化的预防治疗打下基础。方法：设计合适的ApoE基因敲除的CRISPR/Cas9靶点,并组装CRISPR/Cas9打靶质粒；通过CRISPR/Cas9质粒与表达G418抗性的tdTomato质粒共转染猪胎儿成纤维细胞,经过抗性筛选和PCR产物测序的方式鉴定出ApoE基因双敲的单细胞克隆；以筛选获得的ApoE基因双敲的猪胎儿成纤维细胞单克隆作为体细胞核移植供体,通过体细胞核移植（SCNT）技术,构建国际上首例ApoE基因双敲的克隆... 

【文章来源】：南京医科大学江苏省

【文章页数】：67 页

【学位级别】：硕士

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英文摘要
前言
第一部分 ApoE敲除细胞的建立
    1. 实验仪器与材料
        1.1 实验仪器
        1.2 实验材料
        1.3 实验试剂
        1.4 试剂配制
    2 实验方法与步骤
        2.1 猪原代成纤维细胞(PFFs)分离
        2.2 CRISPR/Cas9打靶质粒构建
        2.3 打靶质粒转染猪原代成纤维细胞
        2.4 ApoE基因打靶细胞克隆的筛选及鉴定
    3 实验结果
    4 分析与讨论
第二部分 ApoE基因敲除猪模型的建立和鉴定
    1 实验仪器与材料
        1.1 实验仪器
        1.2 实验材料
        1.3 实验试剂
        1.4 试剂配制
    2 实验方法与步骤
        2.1 ApoE基因敲除猪模型的构建
        2.2 ApoE基因敲除猪的鉴定
    3 实验结果
    4 分析与讨论
参考文献
综述
    参考文献
攻读学位期间发表文章情况及科研工作情况
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]CRISPR/Cas9基因组编辑技术及其在动物基因组定点修饰中的应用[J]. 周金伟,徐绮嫔,姚婧,余树民,曹随忠.  遗传. 2015(10)
[2]利用TALEN技术在牛胎儿成纤维细胞中敲除Myostatin基因[J]. 杨翠翠,佟慧丽,马兴红,杜巍,刘丹,杨宇,严云勤.  遗传. 2014(07)
[3]条件性剔除鼠在神经元发育过程中的应用[J]. 刘长红,武明花,李桂源.  临床与病理杂志. 2014(02)
[4]利用CRISPR/Cas9敲除大鼠胰岛素受体底物1（Irs1）基因[J]. 马元武,马婧,路迎冬,陈炜,张旭,于磊,张连峰.  中国比较医学杂志. 2014(03)
[5]Targeted Mutagenesis in Zea mays Using TALENs and the CRISPR/Cas System[J]. Zhen Liang,Kang Zhang,Kunling Chen,Caixia Gao.  Journal of Genetics and Genomics. 2014(02)
[6]CRISPR/Cas9 and Genome Editing in Drosophila[J]. Andrew R.Bassett,Ji-Long Liu.  Journal of Genetics and Genomics. 2014(01)
[7]锌指核酸酶技术在植物基因工程中的应用[J]. 宋芸,乔永刚,李贵全.  中国生物工程杂志. 2013(01)
[8]转基因动物新技术研究进展[J]. 罗庆苗,苗向阳,张瑞杰.  遗传. 2011(05)
[9]锌指蛋白核酸酶的作用原理及其应用[J]. 钟强,赵书红.  遗传. 2011(02)
[10]转基因动物研究进展[J]. 李想,逍遥,张鑫,杨利国.  中国奶牛. 2009(12)

博士论文
[1]应用TALENs以及CRISPR/Cas9技术构建B细胞缺失免疫缺陷猪模型[D]. 陈凤娇.南京医科大学 2015

硕士论文
[1]转基因克隆兔的相关研究[D]. 宋伟杰.东北林业大学 2011
[2]ApoE/LDLR双基因缺失小鼠炎症相关基因的表达研究[D]. 戴学栋.山东师范大学 2008



本文编号：3445437