抗流感病毒单克隆抗体CR6261在糖基工程酵母中的表达及分析

发布时间：2021-11-10 08:20

　　目的:在糖基工程酵母中表达抗流感病毒单克隆抗体CR6261,并对其进行结构分析和活性测定。方法:从GenBank获得CR6261抗体的全基因序列,构建轻重链表达载体pPICZα-CR6261-H-L,电转入糖基工程酵母,利用甲醇诱导型启动子AOX1表达CR6261抗体蛋白,通过SDS-PAGE、Western印迹筛选表达菌株,用Protein A亲和层析、Superdex200凝胶过滤柱分离纯化抗体蛋白,应用ELISA方法对纯化后的蛋白进行活性鉴定。结果:CR6261抗体蛋白分泌在培养上清中,且纯化后的蛋白与糖基工程酵母表达的流感病毒血凝素蛋白HA5、HA7有结合活性,与商业化三价流感病毒裂解疫苗亦有结合活性。结论:实现了抗流感病毒单克隆抗体CR6261在糖基工程酵母中的表达,并初步检测了其广谱活性,可为酵母表达抗体蛋白药物制备提供参考,ELISA初步评价还显示了其在诊断上的应用前景。 

【文章来源】：生物技术通讯. 2020,31(01)

【文章页数】：5 页

【部分图文】：

阳性克隆的筛选

用间接ELISA方法检测CR6261抗体的活性，抗原为本实验室表达并纯化的血凝素HA5、HA7、HA3以及购买的商品化三价流感病毒裂解苗。将HA5、HA7、HA3、裂解苗分别用抗原包被液进行1/10稀释，各取200μL样品加入96孔酶联板第一排，其他排各加入100μL包被液，排枪吸取第一排100μL液体加到下一行中，倍比稀释；37℃包被1 h，加入PBST清洗1次，每孔加入5%牛奶封闭液；37℃孵育1 h,PBST清洗5次；每孔各加入纯化后的CR6261抗体（用5%牛奶进行1/500稀释，且加入200μL酵母裂解液）；37℃温育1 h，用PBST洗5次；37℃温育1 h，用PBST水洗5次；每孔各加入100μL羊抗人IgG-HRP（用5%牛奶进行1/5000稀释，且加入200μL酵母裂解液）；37℃温育1 h，用PBST洗5次；每孔各加100μL显色液，显色5～10 min；每孔加入50μL终止液终止显色；酶标仪读数，计算抗体滴度。2 结果

1 L BMGY液体培养基培养的菌液上清经Protein A纯化，洗脱样品进行还原SDS-PAGE分析，如图4A所示，Protein A纯化后的样品存在大量降解条带。用Superdex200对样品进一步纯化，并对洗脱样品进行还原SDS-PAGE分析，结果如图4B，色谱图紫外吸收峰为单一吸收峰，说明洗脱样品分子大小相近，从蛋白条带位置来看，CR6261抗体的轻重链均有表达且分子大小与阳性IgG轻重链大小一致。经2步纯化后获得了纯度较高的抗体蛋白。2.4 CR6261抗体活性分析

【参考文献】：
期刊论文
[1]甲型H1N1流感病毒血凝素HA1在糖基工程毕赤酵母中的表达[J]. 张晓红,刘波,巩新,唱韶红,徐威,吴军.  生物技术通讯. 2012(01)
[2]N-糖基工程研究进展[J]. 吴军,刘波.  生物产业技术. 2009(04)
[3]抗HER2人源化单克隆抗体在毕赤酵母中的表达及其产物分析[J]. 王凌雪,张惟广,吴军.  生物技术通讯. 2008(06)



本文编号：3486920