以斑马鱼为模式动物研究转录因子Irf8及Pu.1在髓系白血病发生过程中的作用

发布时间：2017-05-07 15:13

  本文关键词：以斑马鱼为模式动物研究转录因子Irf8及Pu.1在髓系白血病发生过程中的作用，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：单核细胞(如巨噬细胞)和多形核吞噬细胞(粒细胞)的发育异常可能导致严重的髓系疾病,如骨髓异常增生性疾病,更严重的可导致髓系白血病的发生。髓系白血病的主要特征是处在不同发育阶段的髓系细胞异常增生,众多研究结果已经报道了肿瘤抑制基因突变、原癌基因活化等因素可导致这一疾病的发生,与此同时,转录因子(如IRF8、PU.1)等也在其中扮演着非常重要的角色。在髓系细胞谱系分化过程中,干扰素调节因子8(IRF8)的作用尤为重要,它的缺失可导致粒细胞的异常增生以及巨噬细胞和树突状细胞的大量减少。同样的,在髓系白血病发生过程中IRF8也扮演着很重要的作用。研究表明,在小鼠中敲除Irf8会导致一个类似于慢性髓系白血病症状的发生,在慢性(CML)和急性(AML)的病人中,IRF8表达下调,这暗示着它可能是一个致病因子,与此同时,IRF8表达的下调对于BCR-ABL诱导的CML的发生是必需的。因此,在髓系白血病发生过程中,IRF8通常被视为一个肿瘤抑制因子。然而遗憾的是,对于IRF8在髓系细胞发育以及白血病发生过程中的确切作用机制,仍然知之甚少。PU.1,是ETS家族中的一员,也是另一个对于髓系细胞及白血病发生起着重要作用的转录因子。一般情况下,IRF8通过IRF关联结构域与PU.1协同作用于髓系细胞发生,与此同时,它们还可以调控p15mk4b的表达,p15ink4b是一个非常重要的细胞周期蛋白依赖的蛋白激酶抑制剂,在AML中常常失去活性。因此,这三者在白血病发生过程中可能协同作用,但遗憾的是,在活体内关于它们功能和联系的研究仍然较少,这可能归咎于Pu.1突变小鼠的致死性,从而无法得到Pu.1与Irf8的双突变纯合子小鼠,以研究它们在生物体内的相互作用。近年来,斑马鱼(Danio rario)已经成为一种重要的模式生物,因其适合大规模遗传突变及药物筛选,用其研究髓系细胞发生以及构建白血病发生模型已经成为热点。在斑马鱼中,髓系细胞在多个造血过程中产生,研究已经报道了在原始造血过程中,Irf8作为Pu.1下游的一个关键转录因子调控髓系前体细胞的命运决定,然而,在永久造血及成年斑马鱼中它们的功能还尚未被细致研究。本研究通过TALENs技术获得了irf8的几个突变纯合子,在突变体中,不论是在幼鱼还是在成鱼阶段,巨噬细胞都显著减少,这表明Irf8对于巨噬细胞的产生和维持都是必需的。通过细胞周期分析及凋亡检测实验,发现Irf8紧密调控髓系细胞增殖和凋亡,因此,成年irf8-/-快就可以表现出类似于骨髓增生异常的症状,随着时间推移,这种症状会越来越严重并出现高死亡率,而移植实验证明了它类似于髓系白血病的症状。这是首次通过内源基因敲除而在斑马鱼上构建的第一个髓系白血病模型,为在斑马鱼上进一步研究髓系白血病的发生提供了一个很好的工具。此外,通过使用一种白血病临床治疗药物拓扑替康,很大程度上降低了突变体中异常增生的粒细胞的数目。因此,rf8△57/△57也许可以作为一个很好的模型用于筛选与髓系细胞发育调控及白血病治疗有关的药物。与此同时,在构建的irf8与pu.1的双突变纯合子irf8△57/△57/pu.1G242D/G242D中,粒细胞的浸润相较irf8突变体更严重,同时在肝脏和肠道中出现许多大量堆积的坏死的白细胞,这提示在双突变体中,肝脏和肠道的功能可能已经发生异常,而这与我们观察到其相较irf8变体而言出现的超高死亡率相一致。然而非常奇怪的是,在双突变体中,blast细胞的数目反而降低了,这可能意味着在髓系白血病发生过程中,Pu.1和Irf8扮演着不同角色。此外,我们还进行了ENU筛选,以期获得与髓系细胞发育相关的突变体。我总共筛选得到了8个突变体,非常幸运的是,其中有一个irf8的突变体,它的起始密码子“ATG”突变成了“ACG”,从而丧失了功能。对其进行表型分析,显示其与通过TALENs技术得到的突变体表型类似,都出现了粒细胞与巨噬细胞的发育异常。
【关键词】：irf8 pu.1 斑马鱼 髓系白血病发生
【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R733.7;R-332
【目录】：

• 摘要8-10
• ABSTRACT10-12
• 第一部分：文献综述12-19
• 1.1 髓系白血病12-13
• 1.2 斑马鱼的造血过程13-14
• 1.3 IRF8和PU.1调控髓系细胞发育的研究进展14-15
• 1.4 TALENs介导的基因敲除技术15-17
• 1.5 ENU介导的正向遗传突变筛选17-19
• 第二部分：材料与方法19-40
• 2.1 实验动物19
• 2.2 试剂、耗材和仪器19-21
• 2.2.1 主要试剂19-21
• 2.2.2 主要耗材21
• 2.2.3 主要仪器21
• 2.3 试剂配方21-24
• 2.3.1 LB培养基21-22
• 2.3.2 原位杂交相关试剂22-23
• 2.3.3 抗生素溶液23
• 2.3.4 大肠杆菌E.coli化学感受态细胞的制备相关试剂23
• 2.3.5 HE染色液配制23-24
• 2.3.6 其他溶液24
• 2.4 基因组DNA提取24
• 2.5 目的基因片段扩增—聚合酶链式反应24-25
• 2.6 PCR产物纯化25
• 2.7 突变体irf8~(△57/△57)及pu.1~(G242D/G242D)的鉴定25-26
• 2.8 全胚total RNA提取26-27
• 2.9 成年斑马鱼肾脏血血液细胞total RNA提取27
• 2.10 cDNA第一条链合成27
• 2.11 实时荧光定量PCR27-28
• 2.12 大肠杆菌E.coli化学感受态细胞的制备28-29
• 2.13 体外合成mRNA29-30
• 2.14 质粒转化与扩增30-31
• 2.15 反义RNA探针的制备31-32
• 2.15.1 线性化模板31
• 2.15.2 反义RNA探针的合成和纯化31-32
• 2.16 胚胎显微注射32-33
• 2.17 苏丹黑B染色33
• 2.18 中性红染色33
• 2.19 全胚免疫荧光化学33-34
• 2.20 全胚RNA原位杂交34-35
• 2.21 全胚TUNEL实验35-36
• 2.22 胚胎活体AO(Acridine Orange)染色36
• 2.23 成年斑马鱼肾脏血血液细胞提取36
• 2.24 成年斑马鱼外周血血液细胞涂片制备36
• 2.25 成年斑马鱼肾脏血血液细胞涂片制备36-37
• 2.26 吉姆萨染色37
• 2.27 成年斑马鱼肾脏血血液细胞移植37
• 2.28 石蜡切片制备37-38
• 2.29 石蜡切片HE(苏木精—伊红)染色38
• 2.30 石蜡切片荧光免疫组织化学38-39
• 2.31 石蜡切片TUNEL与抗体共染39-40
• 第三部分：实验结果40-63
• 3.1 通过TALENs技术获得irf8突变体40-42
• 3.1.1 突变位点的选择与TALENs质粒构建40
• 3.1.2 irf8突变体产生与筛选鉴定40
• 3.1.3 irf8突变体蛋白稳定性检测40-42
• 3.2 原始造血过程中irf8突变体的表型分析42-43
• 3.3 胚胎发育的永久造血过程中irf8突变体表型分析43-46
• 3.4 irf8突变体中microglia缺失导致胚胎早期CNS中凋亡细胞显著增多46-48
• 3.5 irf8调控斑马鱼幼鱼时期的髓系细胞增殖48-50
• 3.6 Irf8缺失导致成年斑马鱼表现出类似CML的症状50-54
• 3.6.1 irf8突变成鱼血相分析50-51
• 3.6.2 irf8突变体粒细胞在组织器官中大量浸润51-53
• 3.6.3 irf8突变体肾脏血细胞移植实验53-54
• 3.7 Irf8作为肿瘤抑制因子调控髓系细胞增殖和凋亡54-56
• 3.8 在双突变体irf8~(157/△57)/pu.1~(G242D/G242D)中不成熟的粒细胞大量增生56-58
• 3.8.1 双突变体irf8~(△57/△57)/pu.1~(G242D/G242D)的获得及存活率追踪56
• 3.8.2 双突变irf8~(△57/△57)/pu.1~(G242D/G242D)成鱼血相分析56-58
• 3.8.3 双突变irf8~(△57/△57)/pu.1~(G242D/G242D)幼鱼髓系细胞分析58
• 3.9 irf8突变体背景上pu.1功能缺陷会导致髓系细胞大量浸润及器官异常58-60
• 3.10 ENU遗传突变筛选得到irf8的点突变体60-63
• 3.10.1 ENU筛选得到microglia发育缺陷/异常的突变体60-62
• 3.10.2 V5-2突变体突变位点鉴定62-63
• 第四部分：讨论与分析63-65
• 参考文献65-69
• 附录69-71
• 致谢71-72
• 在读期间发表的文章72-73
• 在读期间参加研究课题情况73

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