家蚕丝腺生物反应器表达手足口病疫苗EV71的研究

发布时间：2017-05-07 14:15

  本文关键词：家蚕丝腺生物反应器表达手足口病疫苗EV71的研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：家蚕(Bombyx mori)是一种被驯化和利用5000年之久的重要经济昆虫,在我国农业、工业及科学研究中都占有重要的地位。丝腺是家蚕合成和分泌丝蛋白的特化器官,丝蛋白在五龄后期随核内有丝分裂大量合成,以丝状物形式高效分泌出来,结成一个重约0.5g的蚕茧。由于具有高效的蚕丝生产能力,加之饲养简单、生产成本低廉等优点,家蚕成为合成和生产外源蛋白的理想生物反应器。近年来,整个亚太地区,特别在中国手足口病(Hand, foot and mouth disease,HFMD)的爆发和流行,严重威胁着这一地区婴幼儿的健康。目前针对此病还没有特别有效的治疗药物,亟需开发一种抗原谱广、免疫原性高、安全稳定的疫苗,是预防这一疾病的根本措施。本论文利用含有piggyBac转座子基础元件的原始质粒,构建了中部丝腺组织与时空特异表达手足口病疫苗的转基因质粒,采用胚胎显微注射技术,经过遗传转化得到转基因阳性品系。为了提高外源蛋白的分离纯化效率,通过获得的转基因家蚕品系与丝胶茧突变体Nd-s品系杂交和筛选,我们得到了丝胶茧阳性品系。从个体生长发育过程和Inverse PCR结果可知,所转外源基因不影响家蚕幼虫个体的生长发育。RT-PCR 和 QPCR的结果显示目标基因VP1在中部丝腺特异性地高表达。SDS-PAGE 和 western blotting实验进一步证明VP1蛋白的成功表达。在探索VP1蛋白的分离纯化条件时,首先通过阳性丝胶茧不同处理时间的实验,我们得到丝胶茧的最适处理时间为60h。然后对比浓缩过的正常阳性茧和直接提取的丝胶茧的外源蛋白的提取效率,结果显示,每个丝胶茧和正常阳性茧中的VP1蛋白分别为41.7gg和9.8μg。根据目标蛋白大小,首先将上述两样品的总蛋白通过50kd的浓缩柱,再将过滤液通过30kd的浓缩柱,如此重复浓缩纯化3-5次,通过分子筛的原理即可得到比较纯净的VP1蛋白。通过和BSA蛋白标准品(1、2和5μg)对比,SDS-PAGE结果显示,每个丝胶茧和正常阳性茧得到目标蛋白分别为500ng和550ng,纯度分别为90%和70%。后经过ELISA活性检测,VP1抗原蛋白可以很好地和EV71VLP综合性抗体和mD5单克隆抗体结合,显示出良好的生物活性。以上结果证明了VP1蛋白成功高效地表达并分泌到丝胶茧中。为了提高VP1外源蛋白的表达量,我们尝试利用CRISPR/Cas9介导的定点整合技术将VP1和红色荧光蛋白的表达框序列定点插入到sericin1基因的翻译起始位点,然后借助serl基因内源启动子活性以及多线染色体的核内有丝分裂高效转录活性,试图最大可能地提高外源基因的表达量。我们构建了单、双靶点两种类型的donor,分别得到GO代蛹期嵌合体20头和8头,占蛹总数的7.14%和5.03%。其中,两种Donor得到的生殖腺特异的嵌合体占总嵌合体个数的比例分别为60%和50%。遗憾的是,这些嵌合体没有成功地通过遗传转化成稳定遗传的阳性品系。Cas9/sgRNA切割效率的检测,结果显示两个位点均有活性,但都不高,这可能没有得到阳性品系的原因。
【关键词】：家蚕 VP1 转基因技术 CRlSPR/Cas9 定点整合
【学位授予单位】：福建农林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R392
【目录】：

• 摘要7-9
• ABSTRACT9-11
• 第一章 绪论11-22
• 1.1 引言11
• 1.2 EV71疫苗的研究进展11-12
• 1.3 家蚕生物反应器的研究进展12-19
• 1.3.1 家蚕核型多角体病毒(BmNPV)表达系统13
• 1.3.2 piggyBac转座子介导的转基因遗传操作系统13-17
• 1.3.3 家蚕丝腺生物反应器的存在的问题分析和发展趋势17-19
• 1.4 本项目的研究意义、内容及技术路线19-22
• 1.4.1 研究背景与意义19-20
• 1.4.2 研究内容20-21
• 1.4.3 技术路线图21-22
• 第二章 转基因家蚕介导的EV71疫苗的表达研究22-49
• 2.1 引言22
• 2.2 材料与试剂22-26
• 2.2.1 家蚕品系及饲养条件22
• 2.2.2 主要药品、试剂和试验仪器22-26
• 2.3 实验方法26-42
• 2.3.1 转基因质粒的构建26-34
• 2.3.2 体外转录Helper mRNA(IFP2)34-35
• 2.3.3 家蚕胚胎显微注射和荧光筛选方法35-36
• 2.3.4 Inverse PCR检测插入位点36-37
• 2.3.5 家蚕丝腺RNA提取37
• 2.3.6 RT-PCR和QPCR37-39
• 2.3.7 家蚕活性蛋白的分离纯化39-41
• 2.3.8 家蚕活性蛋白的鉴定41-42
• 2.4 结果分析42-47
• 2.4.1 丝胶茧阳性品系获得42-44
• 2.4.2 VP1基因在家蚕个体中表达分析44-45
• 2.4.3 VP1蛋白的分离纯化45-47
• 2.4.4 VP1蛋白的活性鉴定47
• 2.5 讨论47-48
• 2.6 本章小结48-49
• 第三章 基于CRISPR/CAS9家蚕基因组编辑技术的EV71疫苗的表达研究49-62
• 3.1 引言49
• 3.2 材料与试剂49-50
• 3.2.1 家蚕品系及饲养条件49-50
• 3.2.2 主要药品、试剂和试验仪器50
• 3.3 实验方法50-57
• 3.3.1 Donor质粒的构建方法50-52
• 3.3.2 体外转录Cas9 mRNA、Sericin1 sgRNAs和Bmku70 dsRNA52-55
• 3.3.3 家蚕胚胎显微注射和荧光筛选方法55
• 3.3.4 突变体基因组DNA提取以及突变检测55-57
• 3.4 结果分析57-60
• 3.4.1 基因组整合位点及Donor载体设计57
• 3.4.2 蛹期GO代嵌合体红色荧光的表达57-58
• 3.4.3 Cas9/sgRNA切割效率的检测58-60
• 3.5 讨论60-61
• 3.6 小结61-62
• 结论62-63
• 引用文献63-68
• 致谢68

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