Zmp1慢病毒载体的构建及其对RAW264.7细胞自噬功能的影响

发布时间：2021-11-23 03:04

　　目的:1.构建Zmp1慢病毒载体LV2-zmp1,用LV2-zmp1重组慢病毒感染巨噬细胞RAW264.7细胞,使Zmp1基因在巨噬细胞RAW264.7中稳定表达。2.慢病毒LV2-zmp1感染巨噬细胞RAW264.7,同时用雷帕霉素诱导自噬和羟氯喹抑制自噬,观察Zmp1对巨噬细胞RAW264.7自噬的影响。方法:1.以结核分枝杆菌基因组为模板,经PCR法扩增出锌离子依赖性金属蛋白酶1（Zmp1）基因,定向克隆至慢病毒表达质粒LV1获得Zmp1重组慢病毒表达质粒LV1-zmp1。将慢病毒表达质粒LV1-zmp1、重组穿梭质粒pGag/Pol、辅助包装质粒pRev、pVSV-G四质粒共转染293T细胞进行病毒包装,转染72h后收集病毒液并进行滴度检测,得到滴度为1x10⁸TU/ml的LV2-zmp1重组慢病毒。用LV2-zmp1重组慢病毒感染RAW264.7细胞,感染96h后采用荧光显微镜观察GFP表达反映病毒的感染情况;提取RAW264.7细胞总RNA,逆转录成cDNA,经RT-PCR检测Zmp1基因在RAW264.7细胞中的表达情况;提取RAW264.7细胞总蛋... 

【文章来源】：重庆医科大学重庆市

【文章页数】：78 页

【学位级别】：硕士

【部分图文】：

重组质粒LV1-zmp1中Zmp1基因的部分测序鉴定结果

2.3 重组慢病毒 LV2-zmp1 的滴度检测在荧光显微镜下，结合稀释倍数，计算出各剂量组带荧光细胞的比例，得出LV2-zmp1 重组慢病毒原液滴度为 1x108TU/ml（图 1-3）。图 1-2 重组质粒 LV1-zmp1 中 Zmp1 基因的部分测序鉴定结果Fig.1-2 Partial sequence result of Zmp1 gene in the recombinant plasmid LV1-zmp1

31W264.7 细胞中 Zmp1 mRNA 表达水平 感染 RAW264.7 细胞 72 h 后，以β-Actin 作为内参，RT-中 Zmp1 mRNA 表达水平。慢病毒 LV2-zmp1 感染的细产物的表达水平很高。对照 LV-NC 的细胞和空白对照 基因的转录产物的表达水平均相对较低，差异具有统计学）。荧光显微镜观察 LV2-zmp1 感染目的细胞 RAW264.7W264.7 infected with LV2-zmp1 by inverted fluorescence microscope（100×）

【参考文献】：
期刊论文
[1]结核分枝杆菌分泌性酸性磷酸酶（SapM）抑制小鼠巨噬细胞自噬[J]. 胡东,王婉,赵润鹏,徐雪维,邢应如,徐从景,张荣波,吴静.  细胞与分子免疫学杂志. 2016(06)
[2]锌依赖的金属蛋白酶1促进巨噬细胞凋亡[J]. 李鹏,何永林,张继明,方陈城.  细胞与分子免疫学杂志. 2015(12)



本文编号：3512994