利用CRISPR/Cas9基因编辑技术抑制肠出血性大肠埃希菌O157∶H7 StxⅡ基因表达

发布时间：2021-12-11 01:54

　　目的利用CRISPR/Cas9基因编辑技术抑制肠出血性大肠埃希菌（EHEC）O157∶H7StxⅡ基因表达,并评价其对细菌生长的影响及细胞毒性。方法针对EHEC O157∶H7StxⅡ基因设计引物,构建CRISPR/Cas9表达质粒pdCas9-StxⅡ并转化EHEC O157∶H7感受态细胞,采用RT-PCR及胶体金法检测StxⅡ基因表达情况,绘制菌株生长曲线,将菌株培养上清液接种Vero细胞观察细胞病变情况。结果测序分析显示pdCas9-StxⅡ表达质粒被成功构建;转化EHEC O157∶H7（00G097）感受态细胞后,StxⅡ基因mRNA、蛋白表达均受抑制,EHEC O157∶H7生长曲线未受影响（P值均>0.05）。pdCas9-StxⅡ-00G097菌株培养上清液对细胞的毒性效应（CPE为30%）显著低于对照菌株00G097和pdCas9-00G097（CPE均>80%）。结论成功构建的pdCas9-StxⅡ表达质粒能特异抑制EHEC O157∶H7StxⅡ基因表达、降低细胞毒性,为进一步研究志贺毒素StxⅡ在EHEC O157∶H7致病机理和基因工程减毒活菌苗... 

【文章来源】：江苏预防医学. 2016,27(05)

【文章页数】：4 页

【部分图文】：

图２ＰＣＲ法检测ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９质粒转化菌株中ＳｔｘＩＩｍＲＮＡ表达水平电泳图

基因的ｍＲＮＡ表达被抑制。见图２。２．４ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９质粒对菌株生长的影响绘制阴性对照００Ｇ０９７菌株、ｐｄＣａｓ９－００Ｇ０９７和ｐｄＣａｓ９－ＳｔｘＩＩ－００Ｇ０９７菌株在ＬＢ培养基中的生长曲线。３株细菌在各测试点生长速率差异均无统计学意义（Ｐ值均＞０．０５），表明抑制ＳｔｘＩＩ基因表达对菌株的生长无显著影响。见图３。图２ＰＣＲ法检测ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９质粒转化菌株中ＳｔｘＩＩｍＲＮＡ表达水平电泳图图３电转化后３菌株生长曲线２．５胶体金检测ＳｔｘＩＩ蛋白表达结果显示，阴性对照００Ｇ０９７菌株、ｐｄＣａｓ９－００Ｇ０９７菌株均可检出ＳｔｘＩＩ蛋白，而ｐｄＣａｓ９－ＳｔｘＩＩ－００Ｇ０９７菌株中未检测到ＳｔｘＩＩ蛋白，表明该菌株中ＳｔｘＩＩ基因表达被成功抑制。图４胶体金法检测不同质粒转化菌株ＳｔｘＩＩ蛋白表达·５２２·江苏预防医学２０１６年９月第２７卷第５期ＪｉａｎｇｓｕＪＰｒｅｖＭｅｄ，Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ，２０１６，Ｖｏｌ．２７，Ｎｏ．５

均＞０．０５），表明抑制ＳｔｘＩＩ基因表达对菌株的生长无显著影响。见图３。图２ＰＣＲ法检测ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９质粒转化菌株中ＳｔｘＩＩｍＲＮＡ表达水平电泳图图３电转化后３菌株生长曲线２．５胶体金检测ＳｔｘＩＩ蛋白表达结果显示，阴性对照００Ｇ０９７菌株、ｐｄＣａｓ９－００Ｇ０９７菌株均可检出ＳｔｘＩＩ蛋白，而ｐｄＣａｓ９－ＳｔｘＩＩ－００Ｇ０９７菌株中未检测到ＳｔｘＩＩ蛋白，表明该菌株中ＳｔｘＩＩ基因表达被成功抑制。图４胶体金法检测不同质粒转化菌株ＳｔｘＩＩ蛋白表达·５２２·江苏预防医学２０１６年９月第２７卷第５期ＪｉａｎｇｓｕＪＰｒｅｖＭｅｄ，Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ，２０１６，Ｖｏｌ．２７，Ｎｏ．５

【参考文献】：
期刊论文
[1]TALEN or Cas9-Rapid,Efficient and Specific Choices for Genome Modifications[J]. Chuanxian Wei,Jiyong Liu,Zhongsheng Yu,Bo Zhang,Guanjun Gao,Renjie Jiao.  Journal of Genetics and Genomics. 2013(06)
[2]λ-Red重组系统敲除肠出血性大肠杆菌O157:H7细胞毒素stx2基因[J]. 刘变芳,殷先华,吕欣,魏新元,郭蔼光.  中国兽医学报. 2010(07)
[3]肠出血性大肠杆菌Ⅱ型志贺毒素A亚单位单克隆抗体S1D8的制备和初步应用[J]. 曾晓燕,焦永军,郭喜玲,吴涛,陈银,史智扬.  江苏预防医学. 2008(01)



本文编号：3533796