精氨酸甲基转移酶PRMT7对干性转录因子的调控及对胚胎干细胞干性维持的影响

发布时间：2017-05-10 14:17

  本文关键词：精氨酸甲基转移酶PRMT7对干性转录因子的调控及对胚胎干细胞干性维持的影响，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：精氨酸甲基转移酶PRMT7是PRMT(Protein Arginine Methyltransf erases)家族的一员,其家族成员能够将S-腺苷甲硫氨酸上的甲基化基团转移到底物蛋白的精氨酸位点上。该修饰对于生命体非常重要,不但这些催化酶广泛存在,都有很多甲基化底物,也同时存在很多结构域识别这一修饰。广泛的存在意味着功能的复杂和多样,PRMT参与包括RNA形成、转录调控、DNA损伤修复、信号转导等诸多过程。像PRMT1、PRMT4、PRMT5、PRMT6它们的催化底物及相应的功能是被大家研究比较多的,而关于另外几个成员的报道较少。我们之所以选择研究PRMT7,一方面关于PRMT7的研究较少,是新被发现的蛋白。另一方面是有PRMT7在胚胎干细胞中高表达的报道,但没有进一步对这种现象的原因、意义深层挖掘。胚胎干细胞(ESC)是从胚胎发育的囊胚期内细胞团中分离出的一类细胞,具有很强的干性,即自我更新和分化成各类成体细胞的能力。胚胎干细胞的干性维持是复杂调控的结果,其中以SOX2、OCT4、C-MYC及KLF4为代表的这类转录因子通过调控大量下游靶基因的转录开启或关闭,对干性维持起到至关重要的作用。这也意味着它们自身的蛋白水平及转录活性需要得到精确的控制。所以在后期寻找PRMT7影响干细胞干性维持的机制时优先从这些调控因子入手。我们首先检测了不同细胞系中内源PRMT7的表达情况,发现它确实在胚胎干细胞中高表达。然后将ES细胞诱导分化,看到其表达水平也随之有所降低。为了检验PRMT7对于干性维持的影响,我们利用其siRNA进行内源敲除实验,发现ES细胞分化程度增加,说明它对于胚胎干细胞干性维持来说是有影响的。接下来我们检测了PRMT7对干性因子包括OCT4等的表达水平、转录活性、翻译后修饰的影响,以揭开PRMT7发挥作用的机制,发现PRMT7与干性因子之间存在相互作用,尤其是与OCT4在体内外反应中都有结合。荧光素酶报告基因实验显示PRMT7可转录激活OCT4,对SOX2和KLF4转录活性却没有影响,说明此调节具有特异性。最后纯化了GST-PRMT7,进行体外甲基化实验,虽然没有看到它甲基化干性因子的信号,但此次实验中发现PRMT7自身存在甲基化修饰。总之,本论文阐示了PRMT7可以调节OCT4并介入胚胎干细胞干性维持。
【关键词】：PRMT7 胚胎干细胞 OCT4 精氨酸甲基化
【学位授予单位】：华东师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R321
【目录】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-11
• 第一章 文献综述11-27
• 1.1 表观遗传学概述11-12
• 1.2 组蛋白修饰12-13
• 1.3 蛋白质甲基化修饰13-16
• 1.4 胚胎干细胞16-18
• 1.5 精氨酸甲基化18-24
• 1.6 精氨酸甲基化酶PRMT7研究现状24-26
• 1.7 总结26-27
• 第二章 实验材料27-37
• 2.1 质粒信息27
• 2.2 抗体信息27
• 2.3 引物序列信息27-29
• 2.3.1 qRT-PCR引物序列28
• 2.3.2 shRNA和siRNA序列28-29
• 2.4 细胞系及相关培养基配制29
• 2.5 细菌及培养基配制29-30
• 2.6 DNA琼脂糖凝胶电泳缓冲液配制30-31
• 2.7 蛋白提取相关试剂配制31-32
• 2.8 SDS-PAGE凝胶及其电泳缓冲液配制32-34
• 2.9 甲基化反应放射自显影溶液配制34-35
• 2.10 其他实验试剂35-36
• 2.11 实验仪器36-37
• 第三章 实验方法37-49
• 3.1 碱性磷酸酶染色37
• 3.2 免疫染色37-38
• 3.3 免疫共沉淀38-39
• 3.4 蛋白质免疫印迹39
• 3.5 RNA抽提、反转及实时荧光定量PCR39-41
• 3.6 原核系统中GST融合蛋白的表达、纯化41-42
• 3.7 体外甲基化实验42-43
• 3.8 细胞实验43-45
• 3.9 荧光素酶报告系统45
• 3.10 克隆构建45-49
• 第四章 实验结果49-67
• 4.1 检测细胞内源PRMT7表达49-50
• 4.2 诱导分化实验50-52
• 4.3 内源PRMT7敲除实验52-55
• 4.3.1 PRMT7敲除对胚胎干细胞的影响52-53
• 4.3.2 PRMT7敲除对干性因子的影响53-55
• 4.4 PRMT7与干性因子之间相互作用检测55-57
• 4.5 PRMT7对干性因子的调控作用57-64
• 4.5.1 PRMT7对干性因子转录活性调控57-60
• 4.5.2 PRMT7对干性因子蛋白水平调控60-64
• 4.6 体外甲基化实验64-67
• 第五章 总结与展望67-70
• 参考文献70-75
• 攻读硕士学位期间发表论文75-76
• 致谢76

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本文编号：354941