小鼠胚胎干细胞分化过程中通过Pax6-GFP报告基因系统高效获得神经祖细胞的研究

发布时间：2022-01-19 03:50

　　神经类退行性疾病如阿尔兹海默病、帕金森综合征、亨廷顿舞蹈症能毁灭性地影响患者的运动能力或记忆功能,给亲属及其社会造成了巨大的负担,且目前尚未有可行的治愈方案,主要原因在于缺乏合适的细胞或动物模型进行药物治疗研究。小鼠胚胎干细胞（mESCs）因其具有能分化成三个胚层细胞的多能性且不存在伦理问题而被广泛运用在各个研究领域。然而,体外mESCs的谱系特化是不同步且难以控制的,就神经谱系的特化而言,目前尚没有一个严格的标准用于指示mESCs的神经分化。神经祖细胞（NPCs）是指可以分化到多种神经元的神经前体细胞,是mESCs分化到神经元的中间态细胞,它既可以通过分离早期胚胎的大脑组织获得,也可以利用ESCs进行体外分化获得,其在临床细胞替代性治疗方面有很大的应用前景。目前,在小鼠ESCs分化到NPCs的过程中,除实时观察细胞表型变化外,没有一个科学的系统行之有效地指示分化的进程,并且体外分化周期长,效率较低,导致最终获得的NPCs细胞数量不足以达到细胞替代治疗的需求,其根本原因还在于调控小鼠ESCs进行神经分化的分子机制尚不明确。因此,亟需一种高效和严谨的系统直观地对小鼠ESCs神经分化进程进... 

【文章来源】：南开大学天津市 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校

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神经祖细胞发生和分化

而神经元不具有可再生能力，要解决此类问题，以神经祖细胞为研究平台能更好地推动神经细胞替代治疗或者神经类药物筛选的研究和运用。传统的体外诱导ES向神经祖细胞方向分化主要有三种策略（图1.2）。基于拟胚体(EB)的分化：将消化后的干细胞悬浮培养时能自发聚集形成EB球，其特性类似于原肠胚，球内的细胞相互作用可导致细胞分化成为三个胚层的多种细胞。通过暴露于视黄酸或HepG2（肝癌细胞系）条件培养基或者特定神经选择性培养基，EB球就能够定向向神经谱系分化，但是其分化效率不高，仅有部分细胞能分化成神经祖细胞[20-24]。基于神经诱导基质饲养层的分化：从胚胎骨髓或者主动脉-性腺-中肾（AGM）区分离出的基质间充质细胞系再在脂肪细胞分化前期，具有高效神经诱导效能。将其与mESCs于无血清条件培养液中共培养，可诱导ES向神经方向分化。通过随时调整条件培养基，用以获得中枢神经系统细胞亚型的定向分化。该方法由于其诱导机制尚不明确，且随机性较强[25

第一章 引言具有Pax6-GFP报告系统的mESCs细胞系，将作为一种理想的工具细胞运用于大规模神经分化相关基因和药物的筛选研究。主要技术路线如下（图1.3）。图 1.3 快速高效获得高纯度NPCs的技术路线图主要实验步骤为：（1）构建GFP同源重组供体质粒、Cas9表达质粒和靶向Pax6基因的特异性sgRNA质粒；（2）通过脂质体转染或电转的方式将质粒导入到mESCs细胞中；（3）通过筛选标记筛选出构建成功的Pax6-GFP mESCs系并完成基因型鉴定；（4）体内和体外对Pax6-GFP细胞系进行神经分化的验证；（5）通过流式分选和培养GFP阳性细胞并鉴定其NPCs属性。


本文编号：3596157