用EPR技术测量蛋白质分子内选定位点之间的距离

发布时间：2022-02-10 04:12

　　生物大分子（如蛋白质）的结构与功能研究是现代生物学的重要研究领域。定点自旋标记结合电子顺磁共振（Site-Directed Spin Labeling ElectronParamagnetic Resonance，SDSL-EPR）技术是目前可以在生理环境下研究蛋白质分子结构的主要方法之一。SDSL-EPR技术利用SDSL技术在生物分子内的目的位点选择性地标记上含有未偶自旋的氮氧自由基，再通过EPR技术测量未偶自旋的波谱状态，通过波谱解析，可以获得标记位点的运动状态和两个未偶自旋间的距离及其变化。其距离测量方法的特点是测距范围宽，受其它因素影响小，对蛋白质结构和构象变化分析更加有效。SDSL-EPR可研究溶液中类似生理环境下的蛋白质，更加适合用于测量结构变化的动态过程，解决了许多生物学研究中的难点问题，例如难以获得结晶的蛋白质结构分析、膜蛋白和大分子蛋白复合体的构象分析、溶液状态下蛋白质的动态变化、蛋白质之间和蛋白质与膜之间的相互作用等。SDSL-EPR距离测量方法目前仍然存在一些问题：由于生物样品的多样性，实际测量中许多因素都可能引起连续波电子顺磁共振（Continues Wave ... 

【文章来源】：中国人民解放军军事科学院北京市

【文章页数】：108 页

【学位级别】：博士

【文章目录】：
缩略词表
摘要
Abstract
前言
第一章 EPR 距离测量原理及其应用
    1 定点自旋标记技术（SDSL）
    2 EPR 距离测量原理
        2.1 偶极-偶极耦合作用
        2.2 EPR 距离计算方法
            2.2.1 CW-EPR 距离计算方法
            2.2.2 Pulsed EPR 距离计算方法
            2.2.3 CW-EPR 与 Pulsed EPR 比较
    3 EPR 距离测量在生物研究中的应用
        3.1 蛋白质结构研究
        3.2 蛋白质相互作用
        3.3 核酸分子研究
        3.4 长距离的测量应用
第二章 连续波 EPR 距离计算软件
    1 软件简介
    2 波谱拟合
        2.1 各类型实验谱拟合
        2.2 波谱反拟合程序
        2.3 高斯拟合程序
        2.4 拟合过程的方法改进
    3 距离计算
        3.1 增宽函数的拟合
        3.2 波谱中心点的选择
    4 本章总结
第三章 双自旋距离刻度分子标尺
    1 标尺分子的设计
    2 C60单/双自旋分子的合成与鉴定
        2.1 材料与方法
            2.1.1 主要分析仪器
            2.1.2 C60单/双加成化合物的合成及分离
            2.1.3 C60单/双自旋化合物的合成与鉴定
        2.2 结果与讨论
            2.2.1 紫外吸收谱
            2.2.2 室温 CW-EPR 实验
            2.2.3 稳定性实验
        2.3 小结
    3 标尺分子距离测量实验
        3.1 材料与方法
            3.1.1 设备与材料
            3.1.2 实验方法
        3.2 结果与分析
            3.2.1 不同温度下 C60单/双自旋分子 EPR 波谱
            3.2.2 不同浓度下 C60单/双自旋分子 EPR 波谱
            3.2.3 不同溶剂下 C60单/双自旋分子 EPR 波谱
            3.2.4 微波功率对 C60单/双自旋分子 EPR 波谱的影响
            3.2.5 本底信号
        3.3 小结
    4 距离刻度实验及刻度标尺的建立
        4.1 不同浓度下波谱增宽效应与双基间距离的关系
        4.2 不同温度下波谱增宽效应与双基间距离的关系
        4.3 不同功率下波谱增宽效应与双基间距离的关系
        4.4 不同溶剂下波谱增宽效应与双基间距离的关系
    5 本章总结
第四章 距离测量蛋白质实验模型的构建
    1 单/双 Cys 点突变 hLSECtin-CRD 结构域蛋白质模型的设计
    2 膜蛋白 hLSECtin-CRD 结构域（野生型）的表达
        2.1 实验材料与设备
            2.1.1 实验材料
            2.1.2 主要试剂与设备
        2.2 实验方法
            2.2.1 载体构建
            2.2.2 hLSECtin-CRD 结构域蛋白的诱导表达
            2.2.3 SDS-PAGE 检测
            2.2.4 Western blotting 检测
            2.2.5 透射电镜检测
            2.2.6 生物功能检测
            2.2.7 数据处理及统计分析
        2.3 结果
            2.3.1 原核表达载体构建
            2.3.2 常规原核表达载体蛋白表达结果
            2.3.3 Tat-hLSECtin-CRD 蛋白表达结果
            2.3.4 细胞亚显微结构
            2.3.5 Tat-hLSECtin-CRD 生物功能检测结果
            2.3.6 小结
    3 单/双 Cys 点突变 hLSECtin-CRD 结构域蛋白的表达与纯化
        3.1 材料与设备
        3.2 实验方法
            3.2.1 单/双 Cys 点突变的引入
            3.2.2 原核载体表达与纯化
            3.2.3 真核载体表达与纯化
        3.3 结果
            3.3.1 单/双 Cys 点突变 hLSECtin-CRD 结构域蛋白的原核表达与纯化
            3.3.2 单/双 Cys 点突变 hLSECtin-CRD 结构域蛋白的真核表达与纯化
    4 本章总结
第五章 总结与讨论
参考文献
文献综述
    参考文献
个人简历
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]电子顺磁共振测量蛋白质分子内选定位点之间距离的方法及应用[J]. 吴可.  生物物理学报. 2010(04)
[2]EPR波谱拟合-傅里叶去卷积距离计算方法[J]. 郭林超,王长振,丛建波,先宏,吴可.  波谱学杂志. 2010(01)
[3]电磁脉冲对大鼠肝脏线粒体膜流动性及脂质过氧化的影响[J]. 王长振,丛建波,先宏,曹晓哲,孙存普,吴可.  中华劳动卫生职业病杂志. 2002(04)
[4]中国地鼠肺正常细胞V79和癌变细胞V79-B1膜上巯基结合位置的性质[J]. 忻文娟,赵保路,张建中.  中国科学（B辑 化学 生物学 农学 医学 地学）. 1984(05)



本文编号：3618225