结核分枝杆菌Rv0674蛋白的表达及其多克隆抗体的制备

发布时间：2022-02-20 10:13

　　目的在大肠埃希菌（E. coli）中表达结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis,MTB）Rv0674蛋白,纯化后制备多克隆抗体,并检测抗体效价。方法用PCR技术从MTB H37Rv基因组中扩增Rv0674基因,克隆至p EASYBlunt E1表达载体后,转化入E. coli BL21（DE3）中,用优化后的IPTG诱导表达条件表达Rv0674蛋白,His trap TM HP亲和层析柱纯化目的蛋白;将纯化的蛋白腹腔注射BALB/c小鼠制备多克隆抗体,ELISA和Western blot法检测抗体效价及特异性。结果成功获得了Rv0674序列正确的重组质粒p EASY-E1-Rv0674,挑选出了高表达Rv0674基因的菌株,确定的最适表达条件为1. 0 mmol/L IPTG 28℃诱导表达8 h,获得了相对分子质量约26 500的可溶性蛋白;免疫BALB/c小鼠后,能刺激小鼠产生多克隆抗体,获得的抗血清具有良好的抗原结合特性,且效价大于1∶51 200。结论成功获得了高纯度的Rv0674蛋白,并首次制备出小鼠抗Rv0674蛋白的多克隆抗体,为进一步研究Rv... 

【文章来源】：中国生物制品学杂志. 2019,32(12)CSCD

【文章页数】：7 页

【文章目录】：
1 材料与方法
    1.1 菌株、质粒及基因组
    1.2 实验动物
    1.3 主要试剂及仪器
    1.4 溶液配制
        1.4.1 裂解（上样）缓冲液（SPB)
        1.4.2 清洗液（CEPB)
        1.4.3 洗脱缓冲（EPB)
        1.4.4 封闭液
        1.4.5 LB液体培养基
    1.5 引物设计及合成
    1.6 Rv0674基因的扩增
    1.7 Rv0674蛋白重组表达质粒的构建
    1.8 Rv0674蛋白重组表达菌株的构建
    1.9 Rv0674蛋白诱导表达条件的优化
    1.1 0 目的蛋白表达形式分析及Western blot鉴定
    1.1 1 重组蛋白的纯化
    1.1 2 抗小鼠血清的制备
    1.1 3 抗体效价的检测
    1.1 4 抗体特异性鉴定
2 结果
    2.1 Rv0674基因扩增产物的鉴定
    2.2 重组表达质粒pEASY-E1-Rv0674的鉴定
    2.3 Rv0674蛋白诱导表达条件的优化
    2.4 表达产物的鉴定
    2.5 纯化产物的鉴定
    2.6 小鼠血清抗体效价
    2.7 抗体特异性
3 讨论


【参考文献】：
期刊论文
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[3]结核分枝杆菌MPT64蛋白多克隆抗体的制备[J]. 李国涛,臧珂.  应用预防医学. 2017(04)
[4]结核分枝杆菌ESX-1分泌蛋白EspB结构和功能分析[J]. 唐晓萌,王大成.  生物化学与生物物理进展. 2017(05)
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[6]结核分枝杆菌特异性蛋白片段Rv3388和6种特异抗原在结核抗体检测中的应用价值[J]. 周鹏,丁莹莹,林子玉,冯娇娇,高彩霞,王锦红,杨华,温宗梅,潘卫,邓松华.  安徽医科大学学报. 2015(10)
[7]痰标本中结核杆菌分泌蛋白抗原检测在活动性肺结核诊断中的应用价值[J]. 李源.  中国卫生检验杂志. 2015(18)
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[10]结核分枝杆菌ESX-1分泌蛋白ESAT-6增强巨噬细胞吞噬功能[J]. 屈野,殷瑛,李浩,刘炬,杨秀旭,董大勇,徐俊杰,陈薇.  微生物学报. 2013(08)

博士论文
[1]十六个结核分枝杆菌新抗原的抗原表位鉴定与评价[D]. 王雪枝.中国疾病预防控制中心 2017



本文编号：3634829