四环素调控人Numb基因过表达慢病毒载体的分步构建

发布时间：2017-05-16 10:05

  本文关键词：四环素调控人Numb基因过表达慢病毒载体的分步构建，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的:本课题旨在构建含有四环素调控人Numb基因过表达调控组份的Lenti-EF1a-RTTA-IRES-Puro慢病毒载体,以及构建含有四环素调控人Numb基因过表达反应组份的Lenti-EF1a-EGFP-TRE-Numb慢病毒载体,并测定它们的滴度,为Numb调控人干细胞“干性”的研究提供实验基础。方法:1、采用酶切技术将Lenti-egfp-IRES-puro载体酶切后获得Lenti-IRES-puro骨架。采用凝胶电泳技术验证rtta基因片段。将rtta基因片段连接到Lenti-IRES-puro骨架上得到Lenti-EF1a-RTTA-IRES-Puro重组质粒。将重组质粒转入到感受态大肠杆菌中进行质粒的扩增,提取质粒通过酶切及基因测序验证后,将Lenti-EF1a-RTTA-IRES-Puro重组质粒、辅助包装质粒delta、pVSVG共转染293T细胞,分别在转染后48小时和72小时收集病毒及浓缩病毒。将病毒稀释后感染293T细胞,48小时后,通过ELISA方法测定其滴度。2、使用酶切技术将Lenti-EF1a-EGFP-TRE-OCT4载体酶切后获得Lenti-EF1a-EGFP-TRE骨架。使用RT-PCR技术从人胚胎干细胞总RNA中获得人Numb基因片段,将人Numb基因片段连接到Lenti-EF1a-EGFP-TRE骨架上得到Lenti-EF1a-EGFP-TRE-Numb重组质粒。将重组质粒转入到感受态大肠杆菌中进行质粒的扩增,提取质粒通过酶切及基因测序验证后,将Lenti-EF1a-EGFP-TRE-Numb重组质粒、辅助包装质粒delta、pVSVG共转染293T细胞,分别在转染后48小时和72小时收集病毒及浓缩病毒。将病毒稀释后感染293T细胞,48小时后,通过DAPI细胞染色方法测定其滴度。结果:1、Lenti-egfp-IRES-puro载体经酶切行琼脂糖凝胶电泳后,观察到有两条条带,显示Lenti-IRES-puro骨架获取成功。rtta基因片段行琼脂糖凝胶电泳后,观察到在1kbp附近有条带,显示rtta基因片段获取成功。克隆的Lenti-EF1a-RTTA-IRES-Puro重组质粒经酶切行琼脂糖凝胶电泳,观察到有两条条带,经基因测序结果为100%正确,显示Lenti-EF1a-RTTA-IRES-Puro重组质粒构建成功。重组质粒与辅助包装质粒共转染293T细胞,感染后48小时收集的Lenti-EF1a-RTTA-IRES-Puro病毒浓缩液滴度为:6.5*10^7TU/ml,感染后72小时收集的Lenti-EF1a-RTTA-IRES-Puro病毒浓缩液滴度为:5.7*10^7TU/ml。2、Lenti-EF1a-EGFP-TRE-OCT4载体经酶切后行琼脂糖凝胶电泳,观察到有两条条带,显示Lenti-EF1a-EGFP-TRE骨架获取成功。采用RT-PCR技术从人胚胎干细胞总RNA中获取人Numb基因片段行琼脂糖凝胶电泳后,观察到在2kbp处有条带,显示人Numb基因片段获取成功。克隆的Lenti-EF1a-EGFP-TRE-Numb重组质粒经酶切后行琼脂糖凝胶电泳,观察到有两条条带,经基因测序结果为100%正确,显示Lenti-EF1a-EGFP-TRE-Numb重组质粒构建成功。重组质粒与辅助包装质粒共转染293T细胞,感染后48小时收集的Lenti-EF1a-EGFP-TRE-Numb病毒浓缩液滴度为:3.5*10^7TU/ml,感染后72小时后收集的LentiEF1a-EGFP-TRE-Numb病毒浓缩液滴度为:2.5*10^7TU/ml。结论:1、含有四环素调控人Numb基因过表达调控组份的Lenti-EF1a-RTTA-IRE S-Puro慢病毒载体构建成功。2、含有四环素调控人Numb基因过表达反应组份的Lenti-EF1a-EGFP-TRENumb慢病毒载体构建成功。
【关键词】：Numb基因 四环素 过表达 慢病毒 干细胞
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R329.2
【目录】：

• 摘要3-5
• ABSTRACT5-10
• 中英文缩略词表10-11
• 第1章 引言11-13
• 第2章 材料13-15
• 2.1 主要仪器及设备13
• 2.2 细胞来源13
• 2.3 主要试剂13-14
• 2.4 试剂的配制14-15
• 第3章 LENTI-EF1A-RTTA-IRES-PURO慢病毒载体的构建及其滴度测定15-25
• 3.1 Lenti-EF1a-RTTA-IRES-Puro质粒的构建15-22
• 3.1.1 实验方法15-19
• 3.1.2 实验结果19-22
• 3.2 Lenti-EF1a-RTTA-IRES-Puro慢病毒的包装及滴度测定22-25
• 3.2.1 实验方法22-24
• 3.2.2 实验结果24-25
• 第4章 LENTI-EF1A-EGFP-TRE-NUMB慢病毒载体的构建及其滴度测定25-34
• 4.1 Lenti-EF1a-EGFP-TRE-Numb质粒的构建25-31
• 4.1.1 实验方法25-28
• 4.1.2 实验结果28-31
• 4.2 Lenti-EF1a-EGFP-TRE-Numb慢病毒的包装及滴度测定31-34
• 4.2.1 实验方法31-32
• 4.2.2 实验结果32-34
• 第5章 讨论34-39
• 5.1 Numb 拮抗 Notch 信号通路34-35
• 5.2 Tet-on系统35-36
• 5.3 Lenti-EF1a-RTTA-IRES-Puro慢病毒载体36-37
• 5.4 Lenti-EF1a-EGFP-TRE-Numb慢病毒载体37-39
• 第6章 结论与展望39-40
• 6.1 结论39
• 6.2 展望39-40
• 致谢40-41
• 参考文献41-43
• 攻读学位期间的研究成果43-44
• 综述44-49
• 参考文献48-49

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前7条

1 陈国庆;杨桦;;Notch信号通路对周围T淋巴细胞活性及分化的调控作用[J];中国免疫学杂志;2013年07期

2 孙丽哲;侯林;;Notch的结构、功能和相关信号通路[J];中国细胞生物学学报;2010年06期

3 吴梅红;王雅杰;;Numb基因在乳腺癌细胞分化中的作用[J];癌症进展;2010年05期

4 廖湘晖;姚伟红;官成浓;;肝细胞肝癌中Numb蛋白与P53蛋白的表达及相关性[J];医学信息;2010年05期

5 谢承志;徐迅迪;;Numb的研究现状及展望[J];中国普通外科杂志;2009年09期

6 谢蟪旭;王萍;李龙江;;Numb在肿瘤发生中的作用机制[J];口腔颌面外科杂志;2009年03期

7 陈小君;叶枫;陈怀增;吕卫国;谢幸;;细胞分裂方向的改变和Numb的表达增高在宫颈鳞癌中的作用[J];实用癌症杂志;2005年05期

中国博士学位论文全文数据库 前1条

1 胡挺松;生殖干细胞与肿瘤干细胞多能性及分裂机制的研究[D];第二军医大学;2009年

  本文关键词：四环素调控人Numb基因过表达慢病毒载体的分步构建，由笔耕文化传播整理发布。

，

本文编号：370514