dCas9-gRNA在卡介苗侵染小鼠巨噬细胞过程中对rab7的调控作用

发布时间：2022-12-22 04:56

　　[目的]分析rab7及其下游相关分子rilp和rep1在卡介苗侵袭巨噬细胞过程中的作用。[方法]利用CRISPRERA在线设计鼠源rab7-gRNA序列,构建dCas9调控质粒,比较调控前后rab7、rilp和rep1的mRNA表达量。[结果]成功设计3条rab7-gRNA,构建重组调控质粒p X330S-2-d Cas9-gRNA-T2A-EGFP; BCG感染后,巨噬细胞内rab7及其下游的rilp和rep1的mRNA水平明显上升（P ＜0. 01）; gRNA1调控后,rab7及下游rilp的mRNA水平明显下降（P ＜0. 05; P ＜0. 01）; gRNA3调控后,rab7及rilp mRNA水平有所下降,但无统计学意义（P＞ 0. 05）。gRNA1和gRNA3调控对rep1 mRNA水平无明显影响（P＞ 0. 05）。[结论]在BCG侵染巨噬细胞过程中,rab7作为晚期吞噬体的标志受到dCas9调控后变化明显,rilp作为rab7的下游效应分子,表达水平与rab7的变化一致,而rep1未见明显变化。三者在MTB寄生过程中的作用还有待深入研究。 

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【文章目录】：
1 材料与方法
    1.1 材料
        1.1.1 实验材料
        1.1.2 试剂
        1.1.3 仪器
    1.2 方法
        1.2.1 gRNA设计及重组载体构建
        1.2.2 小鼠巨噬细胞Raw264.7的培养及转化
        1.2.3 重组质粒转化Raw264.7 的单克隆筛选及卡介苗侵染
        1.2.4 rab7、rilp、rep1 mRNA的表达情况
        1.2.5 数据分析
2 结果与分析
    2.1 gRNA预测与载体构建
    2.2 dCas9-rab7重组质粒验证
    2.3 重组质粒转化巨噬细胞
    2.4 gRNA调控后rab7及下游rilp、rep1基因mR-NA表达情况
3 讨论


【参考文献】：
期刊论文
[1]CRISPR-dCas9调控基因转录的研究进展[J]. 田开仁,薛二淑,宋倩倩,乔建军,李艳妮.  中国生物工程杂志. 2018(07)



本文编号：3723494