多重耐药质粒pYN1在不同种属细菌中的水平转移能力研究

发布时间：2017-05-17 09:01

  本文关键词：多重耐药质粒pYN1在不同种属细菌中的水平转移能力研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：随着抗生素的广泛使用,尤其是前期抗生素不合理的滥用,造成临床和环境中产生严重的耐药性,给人类医疗和健康带来巨大威胁。其中,耐药基因由于在环境中不易降解、能够通过基因水平转移传播等特性而被作为一种污染物提出来,具有比抗生素本身更大的危害性。耐药基因主要存在于细菌的质粒上,其在环境中的水平转移主要通过质粒、转座子和噬菌体介导,其中质粒是最重要的传播方式。本研究在实验室前期工作的基础上,主要对多重耐药质粒在不同种属细菌之间的转移转化能力进行了研究,并探讨了抗生素和重金属暴露条件下对这种传播的影响。主要研究结果如下:一、质粒pYN1在不同细菌中的转化能力研究:pYN1来自于本实验室保存的多重耐药菌株Escherichia coli Ls1,质粒全序列测序结果表明该质粒至少包括对头孢氨苄、四环素、卡那霉素三种抗生素的耐药基因和一个多重耐药超家族基因。将1.5 ug的Escherichia coli Ls1总质粒与100 ul的四种受体菌(枯草芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌和变形杆菌均为抗生素敏感菌株),分别在不同的生长时期,室温下进行不同时间阶段的静置共培养。研究发现该质粒能够与培养18 h以后的处于稳定期的受体菌株发生有效转化并在包含有三种抗生素的平板上产生转化子,对转化子提取质粒并进行琼脂糖凝胶电泳分析,均出现一条与多抗性质粒PYN1大小(约为15kb)一致的条带,从而进一步证明该质粒转化成功。然而该质粒在不同受体菌之间的转化能力存在明显差异,其转化率大小蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)为8.5×10~(-4)变形杆菌(Proteus vulgaris)为4.7×10~(-6)苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)为4.5×10~(-6)枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)为2×10-7。二、抗生素暴露对质粒pYN1在不同菌株中转化能力的影响:通过添加不同浓度、种类的抗生素对于多重耐药质粒pYN1在不同细菌种属之间自然转化的能力的影响进行研究,得到以下结论:抗生素的种类和浓度都会影响该质粒在受体菌中的转化。在头孢氨苄0-0.15 ug/ml、四环素0-0.3 ug/ml、卡那霉素0-1.5 ug/ml的范围内,对于质粒在枯草芽孢杆菌和变形杆菌中的转化效率增加10~2-10~3倍。在苏云金芽孢杆菌和蜡状芽孢杆菌中降低10-10~2倍;对不同处理条件下的受体菌株进行生长曲线测定,发现是降低的趋势;进行SDS-PAGE发现在0.5 ug/ml的卡那霉素和0.2 ug/ml的四环素处理条件下的枯草芽孢杆菌均有一条大于245 kD的蛋白条带的出现;进行HPLC实验分别发现在15.057和14.791 min处出现新峰。推测有可能是与抗胁迫作用相关的蛋白。三、重金属暴露对质粒pYN1在不同菌株中转化能力的影响:选择环境中常见的重金属离子Cu~(2+)、Mn~(2+)、Zn~(2+)、Fe~(2+)研究了在不同剂量重金属离子分别暴露的条件下,对于多重耐药质粒pYN1在不同细菌种属之间自然转化的能力的影响进行研究。结果显示,重金属会影响该质粒在受体菌中的转化。其中,在铜离子浓度0-4 mmol/l范围内,对于枯草芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌和变形杆菌中的转化效率增加了10~2-10~3倍,苏云金芽孢杆菌降低了10~3倍;对于锰离子浓度0-9 mmol/l的条件下,在枯草芽孢杆菌和变形杆菌中的转化率是降低的,在苏云金芽孢杆菌和蜡状芽孢杆是升高的;在锌离子浓度为0-4mmol/l的范围内,对于在枯草芽孢杆菌和蜡状芽孢杆菌中的转化率提高10-10~2倍;对于苏云金芽孢杆菌和变形杆菌几乎没有影响;对于铁离子浓度0-4 mmol/l的条件下,对于在苏云金芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌和变形杆菌中的转化率降低10~2-10~3倍,对于在枯草芽孢杆菌中的转化率是升高的趋势;对于受体菌株生长曲线的测定,发现在不同重金属的处理条件下,对于生长趋势是增加的;对于枯草芽孢杆菌在不同重金属处理条件下菌体全蛋白的表达进行SDS-PAGE研究发现,与对照相比,铜离子、锰离子和锌离子处理条件下的枯草芽孢杆菌新出现一条180 kDa大小的条带,有可能与应对胁迫作用的相关蛋白表达量下调;进行HPLC实验发现在铜离子浓度为2 mmol/l的处理下,与对照组15.072 min出现新峰。推测可能是与应对胁迫作用相关的蛋白。
【关键词】：抗生素 重金属 多重耐药质粒 转化 生态风险
【学位授予单位】：河南师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R378;Q78
【目录】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-12
• 第一章 引言12-24
• 1.1 抗生素的发展历史12-13
• 1.2 抗生素的种类13
• 1.3 抗生素抗性机制的阐明13-14
• 1.4 抗生素抗性的产生与传播迁移14-16
• 1.5 细菌耐药性的检测方法的阐述16-17
• 1.6 抗生素残留对环境的影响17-18
• 1.7 环境中抗生素耐药基因的研究现状18-22
• 1.8 本研究的目的与意义22-24
• 第二章 多重耐药质粒pYN1能否在不同细菌种属之间自然转化的研究24-36
• 2.1 前言24
• 2.2 材料和方法24-31
• 2.2.1 药品24-25
• 2.2.2 培养基25
• 2.2.3 抗生素储备液的制备25
• 2.2.4 抗生素抗性平板的制备25-26
• 2.2.5 主要仪器26
• 2.2.6 实验材料26-27
• 2.2.7 多抗性菌株的活化27
• 2.2.8 多抗性菌的总质粒的提取27-28
• 2.2.9 提取的总质粒与受体菌静置共培养28
• 2.2.10 转化子验证并计数28-30
• 2.2.11 技术路线30-31
• 2.3 结果与分析31-35
• 2.3.1 受体菌生长曲线、抗生素MIC值测定以及转化效率的测定31-33
• 2.3.2 质粒提取33-34
• 2.3.3 转化子验证34-35
• 2.4 小结35-36
• 第三章 添加不同抗生素对于多重耐药质粒pYN1在不同细菌种属之间自然转化的影响的研究36-48
• 3.1 前言36
• 3.2 材料和方法36-40
• 3.2.1 药品及试剂37
• 3.2.2 实验方法37
• 3.2.3 主要实验仪器37-38
• 3.2.4 培养基38
• 3.2.5 实验技术路线38-39
• 3.2.6 转化子计数39
• 3.2.7 聚丙烯酰胺凝胶电泳39-40
• 3.2.8 高效液相对于菌体全蛋白的表达检测40
• 3.3 结果和分析40-47
• 3.3.1 不同头孢氨苄浓度对多抗性质粒转化效率的影响40-41
• 3.3.2 不同四环素浓度对多抗性质粒转化效率的影响41-42
• 3.3.3 不同卡那霉素对多抗性质粒转化效率的影响42-43
• 3.3.4 不同抗生素对枯草芽孢杆菌生长状态及蛋白表达量的影响43-44
• 3.3.5 不同抗生素对变形杆菌生长状态及蛋白表达量的影响44
• 3.3.6 SDS-PAGE检测不同处理状态下枯草芽孢杆菌全蛋白的表达44-45
• 3.3.7 高效液相对于不同处理条件下菌体全蛋白的表达检测45-47
• 3.4 小结47-48
• 第四章 添加不同重金属对于多重质粒pYN1在不同细菌种属之间自然转化的影响的研究48-64
• 4.1 前言48-50
• 4.2 材料和方法50-53
• 4.2.1 材料50
• 4.2.2 化学试剂50
• 4.2.3 培养基50-51
• 4.2.4 常用实验仪器51
• 4.2.5 实验技术路线51-52
• 4.2.6 转化子计数52
• 4.2.7 SDS-PAGE检测不同处理状态下枯草芽孢杆菌全蛋白的表达52-53
• 4.2.8 高效液相53
• 4.3 结果和分析53-61
• 4.3.1 受体菌对重金属最小抑菌浓度53-54
• 4.3.2 不同铜离子浓度对多抗性质粒转化效率的影响54-55
• 4.3.3 不同锰离子浓度对多抗性质粒转化效率的影响55
• 4.3.4 不同锌离子浓度对多抗性质粒转化效率的影响55-57
• 4.3.5 不同铁离子浓度对多抗性质粒转化效率的影响57-58
• 4.3.6 不同重金属对枯草芽孢杆菌生长状态以及蛋白表达量的影响58
• 4.3.7 不同重金属对变形杆菌生长状态以及蛋白表达量的影响58-59
• 4.3.8 SDS-PAGE检测不同处理状态下枯草芽孢杆菌全蛋白的表达59
• 4.3.9 高效液相对于不同重金属处理条件下菌体全蛋白的表达检测59-61
• 4.4 小结61-64
• 第五章 GFP标记多重耐药质粒pYN164-76
• 5.1 前言64-65
• 5.2 材料和方法65-72
• 5.2.1 材料65-66
• 5.2.2 化学试剂66-67
• 5.2.3 培养基67
• 5.2.4 常用实验仪器67
• 5.2.5 实验技术路线67
• 5.2.6 GFP基因的克隆67-69
• 5.2.7 质粒pYN1的提取69-70
• 5.2.8 大肠杆菌DH5α 感受态制备70-71
• 5.2.9 热击法转化大肠杆菌感受态细胞71
• 5.2.10 质粒pYN2的构建71-72
• 5.3 结果和分析72-74
• 5.3.1 转化子的平板验证与荧光显微镜检测72-73
• 5.3.2 转化子的稳定性检测73-74
• 5.3.3 GFP验证74
• 5.4 小结74-76
• 第六章 结论与展望76-78
• 6.1 结论76
• 6.2 展望76-78
• 参考文献78-86
• 致谢86-88
• 攻读学位期间发表的学术论文目录88-89

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