利用CRISPR/Cas9技术敲除miR-146a调控HIV-1复制的效应及机制

发布时间：2023-04-01 08:19

　　目的:HIV-1持续性感染能诱导miR-146a的表达,miR-146a作为免疫系统负调控分子,通过靶向多个免疫系统关键分子,负调控免疫系统,而对于HIV-1感染来说,这种负调控则会被病毒利用,有利于病毒与宿主长期共存,并逐渐累积致病效应。这里我们利用CRISPR/Cas9技术敲除miR-146a,以探索在敲除miR-146a后,能否在一定程度上回复细胞因子,T细胞耗竭分子表达,从而增强免疫反应,抑制病毒复制。方法:首先我们设计了四条针对人前体miR-146a基因序列的gRNA,通过T7EN1实验和T载体测序实验来验证4条gRNA是否能有效编辑前体miR-146a基因。之后我们利用qPCR方法验证在LPS刺激下,验证HEK293T和A549细胞中敲除miR-146a的效果,还利用Western Blot和ELISA的方法检测了 TRAF6、IRAK1、细胞因子的表达变化。接着我们在HIV-1感染的MT2细胞中,利用qPCR技术、Western Blot技术、ELISA技术检测了不同时间点miR-146a、Gag,HIV-1限制因子 MxB、IFITM1、Tetherin,细胞因子 IL...

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中文摘要
Abstact
1. 引言
2. 研究背景
    2.1 HIV-1与获得性免疫缺陷病
        2.1.1 AIDS流行现状
        2.1.2 HIV-1结构和基因
        2.1.3 HIV-1的复制周期
        2.1.4 HIV-1的传播
        2.1.5 HIV-I致病机制
        2.1.6 HIV-1病毒的限制因子
    2.2 MicroRNA-146a
        2.2.1 MicroRNA的简介
        2.2.2 MicroRNA的生成过程
        2.2.3 MicroRNA的作用机制
        2.2.4 MicroRNA受调控的机制
        2.2.5 MiR-146a的发现和靶基因
        2.2.6 miR-146a与天然免疫
        2.2.7 miR-146a与HIV-1
    2.3 HIV-1与细胞因子
    2.4 CRISPR/Cas9基因编辑技术
        2.4.1 基因编辑技术简介
        2.4.2 CRISPR/Cas9技术的前世今生
        2.4.3 Ⅱ型CRISPR/Cas9系统作用原理
        2.4.4 CRISPR/Cas9编辑在HIV/AIDS治疗中的应用
        2.4.5 CRISPR/Cas9编辑miRNA的应用
3. 实验材料和方法
    3.1 主要仪器设备
    3.2 实验材料
        3.2.1 质粒及分子克隆试剂
        3.2.2 细胞
        3.2.3 细胞培养试剂
        3.2.4 抗体
        3.2.5 逆转录聚合酶链反应和实时定量PCR试剂
        3.2.6 蛋白印迹试剂
        3.2.7 转染试剂
        3.2.8 ELISA及CCK8试剂盒
        3.2.9 其他试剂
        3.2.10 培养基的配制及储存
    3.3 实验方法
        3.3.1 感受态细胞的制备
        3.3.2 质粒的构建、鉴定及测序
        3.3.3 重组质粒转化
        3.3.4 提取质粒并鉴定
        3.3.5 转染
        3.3.6 慢病毒的包装
        3.3.7 HIV-1病毒扩增及滴度测定
        3.3.8 慢病毒感染
        3.3.9 细胞基因组提取
        3.3.10 PCR扩增目的基因靶序列片段
        3.3.11 胶回收PCR片段
        3.3.12 T7EN1实验
        3.3.13 T载体克隆
        3.3.14 RNA提取
        3.3.15 RNA逆转录
        3.3.16 Real-time PCR反应
        3.3.17 HIV-1病毒感染MT2细胞
        3.3.18 蛋白印迹检测蛋白
        3.3.19 ELISA
        3.3.20 流式细胞技术
        3.3.21 脱靶效应分析
        3.3.22 统计学分析及图形绘制
4. 实验结果
    4.1 miR-146a抑制剂与miR-146a海绵抑制miR-146a表达
    4.2 CRISPR/Cas9敲除miR-146a的构建与鉴定
    4.3 LentiCRISPR/Cas9慢病毒介导的高效的基因编辑
    4.4 敲除miR-146a的CRISPR/Cas9系统未检测到脱靶效应
    4.5 LPS刺激敲除miR-146a细胞上调细胞因子表达
    4.6 敲除miR-146a上调细胞因子和ISGs表达,并回复了T细胞耗竭标志的低表达
    4.7 敲除miR-146a后抗病毒因子的表达增加,抑制HIV-1复制和再激活
5. 讨论与展望
6. 参考文献
7. 已发表及待发表论文
8. 致谢



本文编号：3776797