高效经济型饲养层细胞制备体系的研究和应用

发布时间：2017-05-20 10:05

  本文关键词：高效经济型饲养层细胞制备体系的研究和应用，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目前广泛使用的丝裂霉素C（MMC）法制备饲养层（Feeder）细胞（简称“传统方法”）有诸多问题有待优化：（1）产量低，成本高，消耗大量的人力物力；（2）易出现细胞增殖抑制不充分；（3）小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）的生物学行为易受影响，得到的Feeder细胞质量不高；（4）操作不灵活，易错过最佳处理时机等。因此，有必要开发新的方法，既能单批获得大量高质量的Feeder细胞，又能保证细胞增殖被充分抑制。 首先，本研究在传统方法基础上进行改进优化，建立了悬浮-贴壁法，它能提高抑制细胞有丝分裂的效率，同时，还能筛选出状态良好的细胞作为Feeder，，提高所得Feeder的质量。而且，我们无需密切观察MEFs的生长密度，不用担心错过最佳处理时间，操作更为灵活方便。 其次，本研究对悬浮-贴壁法进一步优化，建立了利用细胞培养转瓶机CELLSPINSystem快速制备Feeder细胞的方法。CELLSPIN System的搅拌锤可在电磁场作用下不断旋转，能使细胞在悬浮状态下与培养基中的MMC充分接触，可明显提高MMC抑制细胞增殖的效率，缩短处理时间；悬浮状态下处理细胞，回收时无需消化液消化，可减少酶消化带来的细胞损伤，最大限度地保持细胞的良好状态；旋转瓶的容积是普通培养瓶/皿的数倍甚至上百倍，短时间内可处理大量细胞，在提高Feeder制备效率的同时，又能明显降低Feeder细胞的制备成本。所以，细胞培养转瓶机法便于人胚胎干细胞（hESCs）和人诱导型多潜能干细胞（hiPSCS）的大规模生产。
【关键词】：CF-1小鼠胚胎成纤维细胞 饲养层细胞 人胚胎干细胞 人诱导型多潜能干细胞 丝裂霉素C
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R329.2
【目录】：

• 中文摘要4-5
• Abstract5-6
• 英文缩略词表6-9
• 第1章 引言9-20
• 1.1 依赖 FEEDER 的培养体系9-13
• 1.1.1 动物源性 Feeder 培养体系9-11
• 1.1.2 人源性 Feeder 培养体系11-13
• 1.2 FEEDER-FREE 培养体系，组分从不明确到明确的过程13-17
• 1.2.1 成分不明确的条件培养基体系13
• 1.2.2 成分明确的培养体系13-17
• 1.3 新型生物合成材料构建的培养体系17
• 1.4 3D 生物反应器悬浮培养体系17
• 1.5 存在的问题展望17-20
• 第2章 材料与方法20-29
• 2.1 材料20-21
• 2.1.1 主要仪器和设备20
• 2.1.2 主要试剂20-21
• 2.2 实验方法21-29
• 2.2.1 CF-1 MEFs 的原代获取21
• 2.2.2 CF-1 MEFs 的传代21-22
• 2.2.3 CF-1 MEFs 的冻存22
• 2.2.4 CF-1 MEFs 的复苏22
• 2.2.5 传统方法 Feeder 细胞的制备22-23
• 2.2.6 悬浮-贴壁法 Feeder 细胞的制备( 图 2.1 )23-24
• 2.2.7 搅拌式细胞培养转瓶机法 Feeder 细胞的制备( 图 2.2 )24-25
• 2.2.8 细胞计数25
• 2.2.9 EdU 检测25
• 2.2.10 传统方法、悬浮-贴壁法和细胞培养转瓶机法直接贴壁率比较25
• 2.2.11 传统方法、悬浮-贴壁法和细胞培养转瓶机法复苏率比较25
• 2.2.12 传统方法、悬浮-贴壁法和细胞培养转瓶机法存活时间比较25-26
• 2.2.13 流式细胞周期 Feeder 细胞凋亡检测26
• 2.2.14 质谱法 MMC 残余量检测26
• 2.2.15 Feeder 与 hHF-MSC-iPSCs 共培养26
• 2.2.16 hESC 多能性标记物鉴定26-27
• 2.2.17 体外拟胚体形成试验27-28
• 2.2.18 体内畸胎瘤形成试验28-29
• 第3章 实验结果29-47
• 3.1 原代 CF-1 MEFS 获得及传代培养29
• 3.2 传统方法 FEEDER 细胞的制备29-31
• 3.3 悬浮-贴壁法 FEEDER 细胞的制备31-35
• 3.4 搅拌式细胞培养转瓶机法制备 FEEDER 细胞35-37
• 3.5 传统方法、悬浮-贴壁法与细胞培养转瓶机法对比试验37-39
• 3.6 流式细胞周期检测 FEEDER 细胞凋亡39-41
• 3.7 质谱法 MMC 残余量检测41-43
• 3.8 传统方法、悬浮-贴壁法和细胞培养转瓶机法制备的 FEEDER 细胞均能很好的支持 HHF-MSC-IPSCS的生长43-44
• 3.9 HHF-MSC-IPSCS 标记物鉴定44
• 3.10 HHF-MSC-IPSCS 多潜能性鉴定44-47
• 第4章 讨论47-50
• 第5章 结论50-51
• 参考文献51-57
• 作者简介及在学期间所取得的科研成果57-58
• 致谢58

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 Chuanying Pan;Amy Hicks;Colin E Bishop;;SNL fibroblast feeder layers support derivation and maintenance of human induced pluripotent stem cells[J];遗传学报;2010年04期

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本文编号：381288