MNNG诱导人核糖核苷酸还原酶小亚基RRM2/p53R2基因转录机制的研究

发布时间：2023-10-11 23:43

　　MNNG作为一种单功能烷化剂,被认为是环境中广泛存在的化学致癌物。其可以导致DNA断裂、基因突变甚至肿瘤的发生。MNNG诱导的DNA损伤反应可以激活许多修复相关基因。核糖核苷酸还原酶(RNR)催化核糖核苷二磷酸还原为脱氧核糖核苷二磷酸,在DNA合成和修复过程中起重要作用。人核糖核苷酸还原酶由两个相同的大亚基(RRM1)和两个相同的小亚基(RRM2或p53R2)组成两种RR酶,即RRM1-RRM2和RRM1-p53R2。那么MNNG是否可以影响细胞中RRM2或p53R2的表达水平,以及通过何种途径影响至今没有相关报道。 本文研究了MNNG诱导RRM2和p53R2转录上调的作用和机制。(1)我们发现MNNG可以通过转录调控途径诱导RRM2和p53R2基因表达上调,但不影响RRM1的表达水平。而且,MNNG不仅可以诱导RRM2/p53R2的转录上调,同时也导致了它们的核转位。(2)通过检测MNNG处理前后P-H2AX水平,细胞周期分布及细胞凋亡比例,我们发现RRM2主要参与MNNG诱导的DNA损伤修复过程,而p53R2的作用相对较弱。(3)通过DNA pull-down偶联LC-MS/MS筛...

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【学位级别】：硕士

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致谢
中文摘要
Abstract
缩略语
目次
1 引言
2 材料和方法
    2.1 材料
        2.1.1 抗体
        2.1.2 胞系
        2.1.3 胞培养及处理用液
        2.1.4 菌株
        2.1.5 细菌培养基
        2.1.6 质粒
        2.1.7 克隆构建所需试剂
        2.1.8 siRNA干扰相关试剂
        2.1.9 转染相关试剂
        2.1.10 报告基因检测试剂
        2.1.11 Real-time PCR实验相关试剂
        2.1.12 Western blot相关试剂
        2.1.13 免疫荧光相关试剂
        2.1.14 DNA pulldown相关试剂
        2.1.15 银染
        2.1.16 免疫共沉淀相关试剂
        2.1.17 染色质免疫沉淀相关试剂
    2.2 实验方法
        2.2.1 胞培养及处理
        2.2.2 基因组DNA的提取
        2.2.3 PCR
        2.2.4 PCR产物的清洁回收
        2.2.5 DNA的凝胶回收
        2.2.6 连接反应
        2.2.7 感受态细菌的大量制备
        2.2.8 感受态细菌的转化
        2.2.9 细菌质粒DNA的制备
        2.2.10 定点突变
        2.2.11 细胞转染
        2.2.12 Real-time RT-PCR
        2.2.13 细胞中全蛋白的提取
        2.2.14 细胞核蛋白的提取
        2.2.15 Bradford法蛋白定量
        2.2.16 SDS变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及免疫印迹
        2.2.17 报告基因检测
        2.2.18 免疫荧光
        2.2.19 PI-annexin V染色-流式检测细胞凋亡
        2.2.20 DNA pulldown试验步骤
        2.2.21 免疫共沉淀
        2.2.22 染色质免疫沉淀
        2.2.23 统计学分析
3 结果
    3.1 MNNG促进RRM2、p53R2转录水平上调
        3.1.1 MNNG促进RRM2、p53R2蛋白水平上调
        3.1.2 MNNG促进RRM2、p53R2 mRNA水平上调
        3.1.3 MNNG促进RRM2、p53R2启动子报告基因水平上调
        3.1.4 翻译抑制剂CHX可以有效抑制MNNG引起的RRM2、p53R2蛋白水平上调
        3.1.5 转录抑制剂ActD可以有效抑制MNNG引起的RRM2、p53R2 mRNA水平上调
    3.2 MNNG引起RRM2、p53R2核转位,同时入核的RRM2、p53R2参与修复DNA损伤
        3.2.1 MNNG引起RRM2、p53R2核转位
        3.2.2 上调的RRM2、p53R2参与MNNG引起的DNA损伤修复过程
        3.2.3 RRM2表达上调抑制MNNG引起的细胞周期阻滞
        3.2.4 RRM2表达上调抑制MNNG引起的细胞凋亡
    3.3 RRM2基因的转录因子筛选
        3.3.1 RRM2基因的转录因子筛选策略
        3.3.2 RRM2 promoter DNA亲和层析-银染结果
        3.3.3 RRM2启动子DNA pull-down蛋白质谱鉴定结果及功能分类
        3.3.4 报告基因实验筛选在MNNG处理后激活RRM2转录的蛋白因子
        3.3.5 MNNG对E2F3、E2F1及NFY与外源RRM2启动子DNA结合的影响
        3.3.6 MNNG对E2F3、E2F1及NFY与内源RRM2启动子DNA结合的影响
    3.4 MNNG诱导RRM2表达升高依赖于E2F3、NFY的调控作用
        3.4.1 RRM2启动子区包含有多个潜在的E2F、NFY结合位点,其中RRM2启动子-227/-110区段介导了RRM2基因对MNNG的应答效应
        3.4.2 位于RRM2启动子-227/-110区段上的E2F、NFY结合位点对MNNG诱导RRM2启动子报告基因活性上调至关重要
        3.4.3 NFY调控E2F3、E2F1与外源RRM2启动子DNA的结合
        3.4.4 NFY调控E2F3、E2F1与内源RRM2启动子DNA的结合
        3.4.5 分别敲低E2F3、E2F1、NFYB对RRM2报告基因活性的影响
        3.4.6 E2F3、E2F1、NFY及p53对RRM2、p53R2基因mRNA水平的影响
        3.4.7 在p53缺失细胞株H1299中,MNNG对RRM2、p53R2蛋白水平的影响
        3.4.8 E2F1、E2F3、NFY对MNNG引起RRM2蛋白水平上调的影响
        3.4.9 E2F3调控RRM2表达上调在修复MNNG引起的DNA损伤过程中起重要作用
        3.4.10 E2F3参与修复MNNG引起的DNA损伤依赖于RRM2
    3.5 E2F3激活RRM2上调依赖于E2F3与NFY的相互作用
        3.5.1 过表达的E2F3激活RRM2报告基因活性上调,同时此激活作用依赖于NFY
        3.5.2 DP1、NFY及YY1与E2F3具有相互作用
        3.5.3 E2F3与NFY具有相互作用
    3.6 MNNG引起的RRM2表达上调依赖于ATR-CHK1-E2F3信号通路及NFY的表达上调
        3.6.1 MNNG诱导E2F3表达上调不依赖于其mRNA水平
        3.6.2 MNNG处理后E2F3蛋白稳定性增强
        3.6.3 MNNG诱导E2F3上调依赖于上游激酶CHK1
        3.6.4 MNNG激活RRM2表达上调依赖于ATR-CHK1-E2F3信号通路
        3.6.5 MNNG处理后短时间内诱导NFYA、NFYB mRNA水平上调
4 讨论与展望
    4.1 讨论
    4.2 展望
5 结论及创新点
    5.1 结论
    5.2 创新点
参考文献
综述
    参考文献
作者简历及在学期间取得的科研成果



本文编号：3853023