伤寒沙门菌小RNA T64的相关功能研究

发布时间：2017-05-25 05:01

  本文关键词：伤寒沙门菌小RNA T64的相关功能研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的:随着生物信息学预测和分子生物学技术的不断发展,在细菌基因组内发现了越来越多的小RNA(small RNA,sRNA),其作为基因表达的调控因子,在细菌的生命活动中发挥着关键作用。T64为本研究组在伤寒沙门菌中新发现的sRNA,其基因位置和表达特性都已经在前期研究中得到论证,本论文拟对该小RNA在伤寒沙门菌中的相关功能进行探究。方法:1.T64高表达菌株的制备。根据前期研究获得的sRNA T64基因序列,在转录起始端和终止端处分别设计上下游引物,扩增获得编码T64的基因片段,经Nco I和Hind III双酶切,与同样双酶切的质粒pBAD/Myc-His A定向连接,并导入大肠杆菌DH5α。筛选出阳性克隆,从中提取重组质粒电击导入伤寒沙门菌野生株,作为sRNA T64高表达菌株。2.在hfq基因缺陷株中高表达T64。提取携带编码T64的基因片段的重组质粒,电转导入伤寒沙门菌hfq基因缺陷株,在hfq基因缺陷株中诱导T64高表达。3.T64高表达菌株生长曲线测定。将T64高表达菌株和空质粒对照株分别在TSB中振荡培养,每隔1 h检测1次菌液的OD600值,连续测量10 h。以生长时间为横坐标,OD600值为纵坐标绘制生长曲线,比较T64高表达菌株和空质粒对照株的生长情况。4.T64高表达菌株的动力实验。将T64高表达菌株和空质粒对照株培养至对数期(OD600 0.4),加入0.2%(w/v)的阿拉伯糖继续培养0.5 h,以诱导T64表达,分别取T64高表达菌株和空质粒对照株的1μl菌液点种于含0.3%琼脂糖的LB或TSB半固体培养基,37°C培养12 h后测量动力圈直径,比较细菌的动力。5.实时荧光定量pcr检测基因转录水平。细菌经过培养后,以trizol法提取总rna,用特异性引物进行逆转录及实时荧光定量pcr,分析野生株在不同培养基中培养时t64的表达差异,以及t64高表达菌株中生物膜形成相关靶基因的转录水平变化。6.生物膜形成实验。将细菌培养至对数期(od6000.4),加入0.2%(w/v)的阿拉伯糖继续培养0.5h,以诱导t64表达,取菌液接种于96孔板,30°c静置4天,结晶紫染色后570nm比色定量。7.刚果红实验。过夜培养的t64高表达菌株和空质粒对照株菌液离心收菌,用pbs重悬菌体沉淀并调节菌量一致。滴种5μl重悬液到刚果红平板上,28°c静置3天,观察菌苔形态。结果:1.酶切、pcr验证和序列分析结果显示,成功构建阳性重组载体pbad-t64,并将其导入s.typhi野生株,成功制备srnat64高表达菌株(wt+pbad-t64)。2.pcr验证结果显示,伤寒沙门菌hfq基因缺陷株中成功导入了pbad-t64,即菌株Δhfq+pbad-t64制备成功。3.生长曲线结果表明,在一定时间内,t64高表达菌株生长速度明显快于空载体对照株。4.动力实验表明,在tsb半固体培养基中,t64高表达菌株的动力较空质粒对照株稍稍减弱;而在lb半固体培养基中,两者动力几乎无差别。5.荧光定量pcr结果显示,野生株在lb和tsb两种培养基中培养时t64的表达量有差异,在tsb中t64的表达量明显升高;在t64高表达菌株中,生物膜形成相关靶基因fimy、pilp、stcb和stgd转录均上调。6.生物膜形成实验结果显示,t64高表达菌株的生物膜形成能力强于空载体对照株;回补T64基因后,T64缺陷株生物膜形成能力基本恢复;hfq基因缺陷株即使高表达T64也难以形成生物膜。7.刚果红实验结果显示,T64高表达菌株和空质粒对照株都只能形成光滑和白色的菌苔,未展现出与生物膜形成对应的菌落形态。结论:伤寒沙门菌小RNA T64的表达受到培养条件的影响,高表达T64后能促进细菌的生长,并且能在一定程度上抑制细菌的动力。T64有助于伤寒沙门菌形成生物膜并促进生物膜形成相关基因的表达,但不足以消除hfq基因缺失对生物膜形成的抑制作用。
【关键词】：伤寒沙门菌 小RNA T64 生长 动力 生物膜形成
【学位授予单位】：江苏大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R378.22
【目录】：

• 摘要5-8
• ABSTRACT8-14
• 英文缩写索引14-15
• 1 绪论15-19
• 1.1 伤寒沙门菌简介15
• 1.2 细菌中的sRNA15-16
• 1.3 细菌的生物膜16-17
• 1.4 细菌sRNA与生物膜的关系17-18
• 1.5 伤寒沙门菌sRNA T64的研究现状18
• 1.6 本论文研究内容18-19
• 2 本论文的研究目的、技术路线、材料方法19-30
• 2.1 研究目的19
• 2.2 技术路线19-20
• 2.2.1 制备sRNA T64研究模型菌株19
• 2.2.2 分析细菌在不同培养基中T64的表达差异19-20
• 2.2.3 关于T64的功能研究20
• 2.3 实验材料20-22
• 2.3.1 菌株和质粒20
• 2.3.2 主要试剂和材料20-21
• 2.3.3 主要溶液21
• 2.3.4 主要仪器21-22
• 2.4 实验方法22-30
• 2.4.1 伤寒沙门菌T64高表达菌株（WT+pBAD-T64）的制备22-26
• 2.4.2 菌株 Δhfq+pBAD-T64的制备26
• 2.4.3 T64高表达菌株的生长曲线测定26
• 2.4.4 T64高表达菌株的动力实验26
• 2.4.5 各型菌株的生物膜形成实验26-27
• 2.4.6 T64高表达菌株的刚果红实验27
• 2.4.7 T64及其生物膜形成相关靶基因的实时荧光定量PCR分析27-30
• 3 实验结果与讨论30-47
• 3.1 实验结果30-40
• 3.1.1 伤寒沙门菌T64高表达菌株的制备结果30-32
• 3.1.2 菌株 Δhfq+pBAD-T64的制备结果32-33
• 3.1.3 T64高表达菌株的生长曲线33-34
• 3.1.4 T64对伤寒沙门菌动力的影响34-35
• 3.1.5 各型菌株生物膜形成实验的结果35-37
• 3.1.6 T64高表达菌株刚果红实验的结果37-38
• 3.1.7 T64及其生物膜形成相关靶基因转录水平结果38-40
• 3.2 讨论40-47
• 3.2.1 T64高表达菌株的制备40-41
• 3.2.2 T64与细菌动力41-42
• 3.2.3 T64与细菌生长42
• 3.2.4 生物膜结晶紫染色与刚果红实验42-44
• 3.2.5 T64与Hfq44
• 3.2.6 T64生物膜形成相关靶基因44-45
• 3.2.7 T64对生物膜形成相关靶基因的调节45-47
• 4 主要结论及展望47-48
• 4.1 主要结论47
• 4.2 展望47-48
• 参考文献48-57
• 致谢57-58
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文58

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  本文关键词：伤寒沙门菌小RNA T64的相关功能研究，由笔耕文化传播整理发布。

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