结核分枝杆菌Rv2660c蛋白原核重组表达及其免疫活性研究

发布时间：2025-01-18 11:14

　　 目的利用原核表达系统表达、纯化结核分枝杆菌潜伏感染相关蛋白Rv2660c,评价其在血清学方面用于结核病诊断的价值。方法合成Rv2660c全基因核酸序列,构建pET28a-Rv2660c融合表达载体,在原核系统内进行重组表达,亲和层析纯化重组Rv2660c蛋白,采用Western-Blot、ELISA实验分析重组蛋白的免疫反应。结果 pET28a-Rv2660c在大肠杆菌内成功表达重组Rv2660c蛋白,SDS-PAGE电泳鉴定重组蛋白分子量为10.2 KD,与预期一致,Western-Blot结果表明重组蛋白Rv2660c只能与活动性结核患者血清反应,出现一条杂交条带;ELISA结果发现重组Rv2660c蛋白与结核患者血清能产生较强的反应,结核病菌阳患者组、菌阴患者组、潜伏感染组以及健康对照组A450平均值分别为0.52、0.48、0.28和0.25。结论重组结核分枝杆菌Rv2660c蛋白具有一定的免疫原性,对活动性结核病的诊断具有一定的价值,但对结核分枝杆菌潜伏感染的诊断没有价值。

【文章页数】：5 页

【部分图文】：

图1 Rv2660c核酸PCR鉴定凝胶电泳鉴定结果

将合成的Rv2660c核酸序列通过分子克隆技术插入到pET-28a表达载体上,采用菌落PCR的方法进行鉴定,1%的琼脂糖核酸电泳显示扩增片段大小在230bp左右,与预期值相符(图1)。将阳性克隆送华大基因公司测序,测序结果证实构建成功。二、重组Rv2660c融合蛋白表达与....

图2 重组Rv2660c蛋白表达SDS-PAGE分析

重组Rv2660c工程菌经IPTG诱导后可获得目的蛋白的原核表达,经过冰浴超声破碎后,SDS-PAGE电泳发现,在目的分子量10.2KD处有明显的蛋白表达,箭头所示,其中超声破碎上清和沉淀各占50%左右(图2)。表达上清以亲和层析纯化后,150mmol咪唑洗脱液获得的纯化蛋白纯度....

图3 重组Rv2660c蛋白亲和纯化SDS-PAGE分析

将菌阳结核病患者、菌阴结核病患者、潜伏感染者以及健康对照者的血清分别与重组蛋白进行印记实验,实验结果(见图4)。活动性结核患者(包括菌阳患者和菌阴患者)的血清抗体能与获得的重组蛋白发生抗原抗体反应,出现一条明显的杂交条带;而潜伏感染者和健康对照者的血清没有出现杂交条带。表明活动性....

图4 重组Rv2660c蛋白与各类血清Western Blot结果

图3重组Rv2660c蛋白亲和纯化SDS-PAGE分析四、重组Rv2660c蛋白ELISA试验结果

本文编号：4028544