融合蛋白DnaJ-△A146Ply经皮下免疫对小鼠肺炎链球菌感染的保护效果及机制研究
发布时间：2017-06-09 01:05
本文关键词：融合蛋白DnaJ-△A146Ply经皮下免疫对小鼠肺炎链球菌感染的保护效果及机制研究，由笔耕文化传播整理发布。
【摘要】：目的:肺炎链球菌(Streptococcus pneumonia,S.pn)是一种定植在人体鼻咽部的重要病原菌,可引起肺炎、急性中耳炎、脑膜炎、败血症等严重侵袭性疾病。WHO最新研究表明肺炎链球菌是引起全世界儿童死亡的主要原因,在全世界所有五岁以下儿童死亡中占16%。目前,免疫接种是预防肺炎链球菌感染最为有效的方法,而市售S.pn疫苗均是基于血清特异型荚膜多糖而开发的,存在对婴幼儿保护效果低下或血清型覆盖有限、易于血清型转换等不足。因此不依赖于血清型,保护效果好的新型亚单位组分疫苗-蛋白疫苗应运而生。DnaJ-△A146Ply是本研究组构建的肺炎链球菌毒力因子DnaJ和减毒Ply重组融合蛋白。前期研究显示,△A146Ply是一种潜在粘膜佐剂,蛋白疫苗DnaJ-△A146Ply在不添加其他佐剂的情况下粘膜免疫小鼠,可诱导Th17型细胞应答,刺激产生sIgA,有效抵抗S.pn在鼻咽部、肺部定植。皮下免疫为常规免疫方式中较安全快捷的方式之一,也是目前临床应用最广的一种免疫方式,因此本研究拟探索DnaJ-△A146Ply经皮下免疫对小鼠S.pn感染的免疫保护效果及机制,为融合蛋白DnaJ-△A146Ply疫苗的临床前研究提供实验基础。方法:原核表达DnaJ、△A146Ply、DnaJ-△A146Ply和△A146Ply-DnaJ重组蛋白,Ni+柱纯化后去内毒素。LPS检测试剂盒及巨噬细胞实验排除残余lps对后续实验干扰;重组蛋白经皮下免疫c57bl/6小鼠,末次免疫一周后分别构建败血症和定植模型,观察小鼠生存率和鼻咽部肺部细菌载量、肺部炎症浸润情况;使用缺陷小鼠及抗血清体内体外实验,探索体液免疫应答、t细胞免疫应答及cd4+t细胞亚型在dnaj-△a146ply免疫保护效果中作用;elisa检测特异性抗体效价、抗体亚型、脾细胞因子和巨噬细胞因子;rt-pcr检测il-6和tnf-αmrna表达水平。westernblot检测p-akt和p-nf-κb表达水平。结果:成功制备dnaj、△a146ply、dnaj-△a146ply和△a146ply-dnaj4种重组蛋白,sds-page分析纯度达85%以上。去除lps后蛋白中剩余含量小于0.1eu/μg,可满足动物和细胞实验。保护效果评价实验结果显示:dnaj-△a146ply经皮下免疫小鼠可有效刺激机体产生较高效价的特异性igg抗体,dnaj-△a146ply免疫组较pbs对照组(p=0.0405)和dnaj组生存率明显增高、同23价多糖疫苗组相当(p=0.7852),鼻咽部及肺部细菌载量较pbs对照组明显降低(p㩳0.01),肺部炎症浸润也较pbs组明显减弱。体液免疫应答结果显示:蛋白dnaj-△a146ply免疫小鼠后,同野生小鼠相比,μmt缺陷小鼠生存率降低(p=0.0468)、鼻咽部细菌载量明显增加(p=0.0049);dnaj-△a146ply经皮下免疫小鼠刺激机体产生的抗体亚型以igg1、igg2a和igg2b为主,较单独dnaj免疫组其抗体产生的时间更早,抗体滴度更高(p0.01);dnaj-△a146ply抗血清较阴性对照组可明显增强细胞对肺炎链球菌吞噬、杀菌作用(P=0.0160)。DnaJ-△A146Ply抗血清可有效抵抗肺炎链球菌鼻咽部定植及侵袭性感染。细胞免疫应答结果显示:DnaJ-△A146Ply经皮下免疫小鼠后脾细胞因子IL-4、IFN-γ、IL-17A较PBS对照组明显增加(P0.05),而IL-5、IL-10同对照组无明显差异;DnaJ-△A146Ply皮下免疫WT及基因缺陷小鼠,IL-4-/-、IFN-γ-/-和IL-17A-/-小鼠鼻咽部定植较WT小鼠中明显增加(P0.05),同PBS组无差异;IL-4-/-、IFN-γ-/-小鼠生存率较WT小鼠生存率明显降低(P0.05),IL-17A-/-小鼠生存率与WT小鼠无差异。DnaJ-△A146Ply免疫TLR4-/-小鼠后,其鼻咽部细菌载量显著高于WT小鼠(P=0.014),同对照组无显著差异(P=0.2617);而其生存率与WT小鼠无明显差异(P=0.1842)。DnaJ-△A146Ply免疫TLR4-/-小鼠后抗体效价明显低于WT小鼠,但抗体亚型仍以IgG1、IgG2a和IgG2b为主,脾细胞因子IFN-γ、IL-4和IL-17A均同各自对照组无差异,而显著低于WT小鼠免疫组(P0.05)。DnaJ-△A146Ply可刺激腹腔巨噬细胞的细胞因子IL-6、TNF-αmRNA及蛋白水平表达明显上调、增强PI3K/AKt和NF-κB磷酸化;Akt和NF-κB抑制剂可显著减少IL-6和TNF-α表达。结论:△A146Ply具有皮下免疫佐剂效应。DnaJ-△A146Ply皮下免疫小鼠可通过诱导体液免疫和细胞免疫应答共同抵抗肺炎链球菌感染,其定植保护效果以TLR4依赖方式进行。DnaJ-△A146Ply通过激活PI3K/AKt和NF-κB信号通路活化巨噬细胞启动免疫应答。
【关键词】：肺炎链球菌 DnaJ-△A146Ply 免疫应答 巨噬细胞
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R392-33
【目录】：
- 英汉缩略语名词对照4-6
- 中文摘要6-9
- 英文摘要9-13
- 前言13-16
- 1 实验材料16-18
- 2 实验方法18-24
- 3 实验结果24-41
- 4 讨论41-46
- 全文总结46-47
- 参考文献47-52
- 文献综述52-66
- 参考文献58-66
- 致谢66-67
- 攻读学位期间发表的学术论文题录67
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，本文编号：434103
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