TIPE对巨噬细胞的功能影响及其机制

发布时间：2017-06-09 19:11

  本文关键词：TIPE对巨噬细胞的功能影响及其机制，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：背景肿瘤坏死因子α诱导的蛋白8(Tumor necrosis factor alpha induced protein8,TNFAIP8或者TIPE)家族主要包括四个成员:TIPE,TIPE1,TIPE2和TIPE3。他们的基因序列有着高度同源性,主要参与细胞增殖与凋亡、炎症反应和肿瘤的发生。对于维持机体免疫平衡起着重要的作用。目前的研究表明,TIPE是一种分子量为21kDa的胞浆蛋白质,其在介导细胞凋亡、信号转导、肿瘤增生、肿瘤侵袭及肿瘤转移等生理和病理过程中具有重要作用。TIPE除了在一些肿瘤组织和细胞中高表达以外,还高表达在免疫组织和细胞中。现有报道主要集中在TIPE作为一种癌基因可以促进肿瘤的生长、迁移、侵袭及浸润,抑制肿瘤的凋亡。而有关TIPE在免疫细胞活化与功能中的作用目前还鲜有报道。固有免疫应答是免疫体系的第一道防护线,而巨噬细胞又是固有免疫应答中起主要作用的效应细胞,因此研究TIPE是否影响巨噬细胞的增殖与活化及其分子机制具有重要的理论意义和潜在的临床应用价值。目的通过敲低TIPE在小鼠巨噬细胞RAW264.7中的表达,研究TIPE在小鼠巨噬细胞活化和功能中的作用,并初步探讨TIPE影响巨噬细胞活化的分子机制。方法通过敲低RAW264.7细胞中TIPE蛋白表达,培养获得稳定细胞株。显微镜观察细胞形态改变,平板黏附实验检测细胞粘附能力,平板克隆技术和MTT技术检测TIPE对巨噬细胞增殖能力的影响,流式细胞术分析TIPE对巨噬细胞吞噬能力的影响,划痕实验与Transwell实验检测TIPE对巨噬细胞迁移能力的影响,ELISA试剂盒检测TIPE对巨噬细胞分泌炎症性细胞因子IL-1β、IL-6、IL-12、TNFα的影响,Western Blot检测MAPK信号通路中相关信号分子的磷酸化水平。结果体外敲低TIPE在巨噬细胞中的表达之后,显微镜下观察敲低TIPE可以抑制巨噬细胞的伪足形成及其黏附能力;敲低TIPE在巨噬细胞中的表达之后,平板克隆实验结果显示巨噬细胞的独立存活能力及克隆形成能力均明显降低;MTT技术实验结果显示敲低TIPE的巨噬细胞增殖能力明显下降;划痕实验结果显示敲低TIPE的巨噬细胞划痕愈合能力下降,迁移速率降低;将巨噬细胞与FITC标记的Dextran荧光颗粒共培养2h后,流式细胞术检测发现巨噬细胞摄取荧光颗粒的能力明显降低;ELISA试剂盒检测结果表明,巨噬细胞分泌炎症性细胞因子IL-1β、IL-6、IL-12和TNFα的能力明显降低。Western Blot结果显示,在RAW264.7细胞中敲低TIPE表达后,c-Raf、Erk1/2和p38磷酸化水平均降低。以上结果提示敲低巨噬细胞中TIPE的表达,显著抑制巨噬细胞的增殖与功能,这种抑制作用可能和抑制MAPK信号通路中的相关分子的磷酸化水平有关。结论(1)敲低TIPE抑制巨噬细胞的增殖能力、黏附能力、迁移能力、抗原吞噬能力、分泌炎症性细胞因子的能力。(2)敲低TIPE下调MAPK信号通路中c-Raf、Erk1/2和p38的磷酸化水平。
【关键词】：TNFAIP8 巨噬细胞 细胞因子 MAPK
【学位授予单位】：河南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R392
【目录】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-10
• 缩略词表10-12
• 1 引言12-14
• 2 试剂与设备14-22
• 2.1 主要试剂14-15
• 2.2 仪器与设备15-17
• 2.3 主要溶剂的配制17-22
• 3 方法22-34
• 3.1 细胞培养和转染22-24
• 3.1.1 细胞培养22
• 3.1.2 细胞复苏22
• 3.1.3 细胞冻存22
• 3.1.4 细胞消化22-23
• 3.1.5 细胞计数23
• 3.1.6 细胞转染23-24
• 3.2 敲低TIPE稳定株的筛选24-25
• 3.2.1 制作慢病毒颗粒24
• 3.2.2 收集慢病毒颗粒24-25
• 3.2.3 决定最优嘌呤霉素的浓度25
• 3.2.4 慢病毒的感染与筛选25
• 3.3 敲低TIPE水平的验证25-29
• 3.3.1 Western blot检测细胞中TIPE的蛋白表达25-27
• 3.3.2 RT-PCR检测细胞中TIPE基因的表达27-29
• 3.4 细胞功能方面检测29-32
• 3.4.1 细胞黏附能力的检测29
• 3.4.2 细胞增殖能力的检测29-30
• 3.4.3 细胞抗原吞噬能力的检测30
• 3.4.4 细胞迁移能力的检测30-31
• 3.4.5 细胞分泌炎症性因子的检测31-32
• 3.5 统计学分析32-34
• 4 结果34-44
• 4.1 TIPE基因沉默水平的验证34
• 4.2 沉默TIPE的表达抑制RAW264.7 细胞的增殖能力34-36
• 4.2.1 平板克隆实验检测RAW264.7 细胞的增殖能力34-35
• 4.2.2 MTT实验检测RAW264.7 细胞的增殖能力35-36
• 4.3 沉默TIPE的表达抑制RAW264.7 细胞的黏附和迁移能力36-39
• 4.3.1 沉默TIPE的表达抑制RAW264.7 细胞的黏附能力36-37
• 4.3.2 划痕实验检测RAW264.7 细胞的迁移能力37-38
• 4.3.3 Transwell实验检测RAW264.7细胞的迁移能力38-39
• 4.4 沉默TIPE的表达抑制RAW264.7 细胞的抗原吞噬能力39-40
• 4.5 沉默TIPE的表达抑制RAW264.7 细胞分泌炎症性细胞因子40-41
• 4.6 沉默TIPE下调C-RAF、ERK1/2 和P38的磷酸化水平41-44
• 5 讨论44-48
• 6 结论48-50
• 参考文献50-53
• 综述 TNFAIP8家族蛋白研究进展53-63
• 参考文献60-63
• 致谢63-64
• 攻读学位期间参加的学术会议及研究成果64-65

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