GOLPH2敲除小鼠的构建及该蛋白在机体免疫中功能的初步研究

发布时间：2017-06-12 01:04

  本文关键词：GOLPH2敲除小鼠的构建及该蛋白在机体免疫中功能的初步研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：高尔基体磷酸化蛋白2(Golgi phosphoprotein 2,GOLPH2)是新近发现的一种高尔基体驻留蛋白,主要表达在上皮组织中。正常情况下GOLPH2锚定在高尔基体膜上,可能参与蛋白质翻译后修饰等过程,但是病理情况下GOLPH2会被分泌出细胞。有研究发现,在病毒性肝炎、肝硬化、肝细胞癌患者体内,GOLPH2在组织和血清中的表达量会显著上升,因此可以作为肝细胞癌早期检测的血清标记物,并且其特异性和灵敏性优于传统的肝细胞癌生物标记物甲胎蛋白。此外,最近的临床研究表明前列腺癌、肺癌、阿尔兹海默病等疾病患者体内,GOLPH2的表达量也会上升,显示其可能与多种疾病的发生或发展有广泛的关系。IL-12在诱导Th0细胞向Th1细胞分化的过程中起到了关键作用,而Th1细胞在机体抵抗胞内病原体感染以及抗肿瘤的细胞免疫中有重要作用。由于我们在体外实验中发现GOLPH2可以抑制IL-12两个亚基p35和p40在巨噬细胞中的转录,因此我们推测患者体内表达量上调的GOLPH2可以通过抑制IL-12间接地促进疾病的发生。为进一步研究GOLPH2的功能,我们通过TALEN技术构建出GOLPH2敲除小鼠,发现与野生型小鼠相比,GOLPH2敲除小鼠在体型外观、行为方式、血细胞组成、脾细胞组成及其他常见生理指标等方面没有显著区别。由于内毒素休克模型常用来研究机体的急性免疫反应并且能引起机体产生大量的IL-12,因此我们给小鼠腹腔注射LPS建立该模型并检测血清中主要免疫细胞因子的分泌情况。我们发现在注射LPS之后,GOLPH2敲除小鼠血清IL-12含量比野生型小鼠更高,这与我们在细胞水平的实验结果一致。为进一步了解GOLPH2在免疫学中可能起到的作用,我们运用RNA测序技术比较了野生型小鼠和GOLPH2敲除小鼠激活的骨髓来源树突状细胞的mRNA表达谱。测序结果的生物信息学分析显示,GOLPH2可能参与细胞外基质、细胞骨架蛋白等结构成分的调控。综上所述,本研究提供了GOLPH2基因敲除小鼠,并初步探讨了GOLPH2在调节免疫反应中可能起到的作用,为进一步研究其功能提供了一定的理论基础,也为GOLPH2在人类疾病治疗过程中成为药物研发的靶点提供了一定的理论依据。
【关键词】：GOLPH2 巨噬细胞 基因敲除鼠 免疫系统 白介素-12 RNA测序 树突状细胞
【学位授予单位】：上海交通大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R363
【目录】：

• 摘要3-5
• ABSTRACT5-11
• 第一章 绪论11-26
• 1.1 高尔基体的结构与功能11-12
• 1.2 高尔基体磷酸化蛋白 2（GOLPH2）的发现及进一步研究12-20
• 1.2.1 GOLPH2的发现12-13
• 1.2.2 GOLPH2的基因及蛋白结构13-14
• 1.2.3 GOLPH2的分布14
• 1.2.4 GOLPH2的进一步研究14-20
• 1.3 免疫系统的组成和功能20-24
• 1.3.1 固有免疫和适应性免疫20-21
• 1.3.2 适应性免疫的特点21
• 1.3.3 抗原的处理和提呈21
• 1.3.4 抗原提呈细胞21-22
• 1.3.5 T细胞22-23
• 1.3.6 B细胞23-24
• 1.4 研究意义24-26
• 第二章 GOLPH2对IL-12的抑制作用26-36
• 2.1 前言26-27
• 2.2 材料与方法27-33
• 2.2.1 材料27-30
• 2.2.1.1 主要试剂与耗材27-28
• 2.2.1.2 主要仪器28
• 2.2.1.3 小鼠28
• 2.2.1.4 GOLPH2重组蛋白28
• 2.2.1.5 p35和p40启动子报告基因表达质粒28
• 2.2.1.6 DMEM完全培养基28-29
• 2.2.1.7 BMDM诱导培养基29
• 2.2.1.8 荧光素酶检测细胞裂解液（5×）29
• 2.2.1.9 荧光素酶检测底物缓冲液29
• 2.2.1.10 TXS溶液29-30
• 2.2.2 方法30-33
• 2.2.2.1 rGOLPH2 的内毒素去除30
• 2.2.2.2 细胞的培养和传代30
• 2.2.2.3 BMDM的诱导和激活30-31
• 2.2.2.4 RNA的提取及RT-PCR31
• 2.2.2.5 荧光定量PCR31
• 2.2.2.6 RAW264.7 细胞的电转染31
• 2.2.2.7 荧光素酶活性测定31-32
• 2.2.2.8 质粒的转化32
• 2.2.2.9 细菌的培养和质粒提取32
• 2.2.2.10 质粒内毒素的去除32
• 2.2.2.11 数据处理32-33
• 2.3 结果与分析33-36
• 2.3.1 rGOLPH2对巨噬细胞中IL-12 p35和p40转录的作用33-34
• 2.3.2 rGOLPH2对p35和p40启动子活性的效应34-36
• 第三章 GOLPH2基因敲除小鼠的构建36-47
• 3.1 前言36
• 3.2 材料与方法36-39
• 3.2.1 材料36-37
• 3.2.1.1 主要试剂与耗材36-37
• 3.2.1.2 Tail Buffer37
• 3.2.1.3 引物37
• 3.2.2 方法37-39
• 3.2.2.1 GOLPH2敲除小鼠受精卵的制备37-38
• 3.2.2.2 小鼠基因组制备38
• 3.2.2.3 小鼠基因型测序鉴定38-39
• 3.2.2.4 小鼠组织RNA的提取39
• 3.2.2.5 数据处理39
• 3.3 结果与分析39-47
• 3.3.1 F_1代杂合子小鼠的获得39-41
• 3.3.2 敲除鉴定引物的设计41-42
• 3.3.3 敲除纯合子鼠的获得42-45
• 3.3.4 小鼠体内GOLPH2 mRNA的检测45-47
• 第四章 GOLPH2敲除小鼠生理指标的检测及GOLPH2在小鼠急性炎症反应中作用的初步探究47-60
• 4.1 前言47-48
• 4.2 材料与方法48-50
• 4.2.1 材料48
• 4.2.1.1 主要试剂与耗材48
• 4.2.1.2 主要仪器48
• 4.2.2 方法48-50
• 4.2.2.1 脾细胞的分离及流式检测48-49
• 4.2.2.2 血细胞组成及生理指标的检测49
• 4.2.2.3 血清的收集49
• 4.2.2.4 内毒素休克模型的建立49
• 4.2.2.5 ELISA检测血清中细胞因子的含量49
• 4.2.2.6 数据处理49-50
• 4.3 结果与分析50-60
• 4.3.1 GOLPH2敲除小鼠与野生型小鼠外观、行为方式的比较50
• 4.3.2 血细胞组成及生理指标的检测50-53
• 4.3.3 脾细胞组成的检测53-55
• 4.3.4 组织HE染色55-56
• 4.3.5 内毒素休克模型中血细胞组成及生理指标的检测56-58
• 4.3.6 内毒素休克模型中ELISA检测血清细胞因子58-60
• 第五章 BMDC的RNA测序结果及分析60-72
• 5.1 前言60
• 5.2 材料与方法60-61
• 5.2.1 材料60-61
• 5.2.1.1 主要试剂60-61
• 5.2.1.2 BMDC诱导培养基61
• 5.2.2 方法61
• 5.2.2.1 BMDC的诱导和培养61
• 5.2.2.2 BMDC的刺激61
• 5.2.2.3 RNA测序61
• 5.3 结果与分析61-72
• 5.3.1 测序样品及测序方法61-62
• 5.3.2 测序质量评估62-64
• 5.3.3 差异表达基因的统计64-66
• 5.3.4 差异表达基因的验证66-67
• 5.3.5 差异表达基因的GO聚类分析67-70
• 5.3.6 差异表达基因的KEGG Pathway显著性富集分析70-72
• 第六章 全文总结与讨论72-73
• 6.1 全文总结72
• 6.2 进一步研究的方向及展望72-73
• 附表及附图73-75
• 参考文献75-81
• 致谢81-82
• 攻读硕士学位期间已发表或录用的论文和专利82-84

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