基因缺失型天坛株痘苗病毒构建及实验免疫研究

发布时间：2017-06-17 10:12

  本文关键词：基因缺失型天坛株痘苗病毒构建及实验免疫研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：痘苗病毒(vaccinia virus,VACV)具有基因组庞大、宿主范围广,且只在胞浆内复制等特点。因而,作为疫苗载体广泛应用于各种传染病、心血管疾病、免疫缺陷病和肿瘤疾病的治疗领域。虽然,传统的痘苗病毒,如我国的天坛株痘苗病毒,作为疫苗在消灭天花过程中发挥了重要作用,但也常引起程度不等的副作用,如全身乏力、发热、皮疹、脑炎和眼部牛痘感染,尤其对免疫抑制患者、慢性皮肤病患者和心脏病患者尤为严重。目前已开发了多种以痘苗病毒为载体的基因工程活载体疫苗。除了作为表达载体已取得令人瞩目的成绩外,痘苗病毒载体还具有一定的问题,如载体构建程序复杂、外源筛选标记插入困难和重组病毒筛选困难等问题。因此,进一步提高载体疫苗效率、载体的安全性、简化制备程序,仍成为痘苗病毒载体的研究热点。本研究通过同源重组技术、Cre/loxp系统逐步敲除天坛株痘苗病毒上的TC7L~TK2L(包括C7L、C6L、C5L、C4L、C3L、C2L、C1L、N1L、N2L、M1L、M2L、K1L和K2L)、TE3L、TA35R、TB13R及TA66R等基因片段,以达到减弱病毒毒力和缩小病毒宿主范围等目的。随后本研究通过体内外不同实验分析了缺失型痘苗病毒的毒力。首先通过结晶紫染色实验和MTT检测实验分析了缺失型痘苗病毒的细胞内扩散能力和细胞毒性。其次,通过鼻腔接种和颅内接种途径感染小鼠后,观察体重变化和生存率,分析了缺失型痘苗病毒的毒力水平;通过皮内接种途径感染家兔后,观察痘斑大小,分析了缺失型痘苗病毒对皮肤的损伤作用。进而,通过免疫小鼠,分析了缺失型痘苗病毒的免疫原性。包括,T淋巴细胞增殖实验、细胞因子检测实验、特异性抗体检测实验及中和抗体检测实验来进一步分析验证了缺失型痘苗病毒的免疫原性。结果表明,成功构建了缺失TC7L~TK2L、TE3L、TA35R、TB13R及TA66R基因的缺失型痘苗病毒MVTTEAB,遗传稳定性良好。5段基因的缺失不影响缺失型痘苗病毒的形态发生和正常复制。细胞水平检测病毒毒力结果表明,MVTTEAB在细胞中的扩散能力及细胞毒性显著减弱。痘苗病毒在家兔皮肤和小鼠体内的毒力检测表明,5段基因的缺失显著减弱了痘苗病毒在动物体内的毒力,提高了安全性。BALB/c小鼠免疫MVTTEAB后的免疫原性实验结果表明,基因缺失型痘苗病毒可诱导机体产生有效的体液及细胞免疫应答,并保持了其作为疫苗的免疫原性。总之,TC7L~TK2L、TE3L、TA35R、TB13R及TA66R基因的缺失在不影响免疫原性的基础上减弱了病毒毒力,且减小了宿主范围。该病毒载体为重组载体疫苗的研究奠定了基础。
【关键词】：同源重组 天坛株痘苗病毒 毒力 免疫原性
【学位授予单位】：吉林农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R392
【目录】：

• 摘要3-4
• Abstract4-8
• 前言8-9
• 第一篇 文献综述9-27
• 第一章 痘苗病毒免疫逃避9-15
• 1.1 痘苗病毒概述9
• 1.2 细胞外的免疫逃避9-11
• 1.3 细胞内的免疫逃避11-13
• 1.4 结论13-15
• 第二章 痘苗病毒的发展15-27
• 2.1 痘苗病毒起源概述15
• 2.2 第一代痘苗病毒疫苗和全球天花根除运动15-17
• 2.3 第二代痘苗病毒疫苗17-19
• 2.4 第三代痘苗病毒疫苗：在细胞中传代培养而进化19-20
• 2.5 第四代痘苗病毒疫苗：基因工程疫苗的进化20-25
• 2.6 结论25-27
• 第二篇 研究内容27-61
• 第一章 多基因缺失型痘苗病毒的构建及筛选27-44
• 1.1 实验材料27-28
• 1.2 实验方法28-33
• 1.3 实验结果33-42
• 1.4 讨论42-43
• 1.5 小结43-44
• 第二章 多基因缺失型痘苗病毒的生物学特性及毒力分析44-54
• 2.1 实验材料44-45
• 2.2 实验方法45-47
• 2.3 结果47-52
• 2.4 讨论52-53
• 2.5 小结53-54
• 第三章 多基因缺失型痘苗病毒的免疫原性研究54-61
• 3.1 实验材料54
• 3.2 实验方法54-57
• 3.3 结果57-59
• 3.4 讨论59-60
• 3.5 小结60-61
• 结论61-62
• 参考文献62-73
• 附录73-74
• 作者简介74-76
• 致谢76

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本文编号：458075