旋毛虫Nudix水解酶DNA疫苗构建及其诱导的免疫保护
本文关键词：旋毛虫Nudix水解酶DNA疫苗构建及其诱导的免疫保护，由笔耕文化传播整理发布。
【摘要】：旋毛虫病是一种几乎呈全球性分布的食源性人兽共患寄生虫病,主要因生食或半生食含旋毛虫幼虫的猪肉而感染。目前对旋毛虫病尚无有效的预防疫苗和控制方法。因此,世界各国每年投入大量人力、物力及财力用于动物肉类中旋毛虫的检疫与兽用疫苗的研究,希望阻断旋毛虫病由动物向人类的传播。近年来,感染性疾病的预防性DNA疫苗和肿瘤的治疗性DNA疫苗的研究发展很快。DNA疫苗在接种后,其免疫和病毒的自然感染过程相似,促进黏膜免疫的发生,诱导免疫记忆反应,以及交叉保护反应,外源的目的基因可以在体内不断表达蛋白,刺激免疫系统,所以DNA疫苗可诱发机体产生相对持久的免疫反应。旋毛虫对宿主小肠上皮细胞的附着、侵入是其致病的关键,但其侵入机制目前尚不清楚。目前推测旋毛虫对小肠上皮细胞的侵入可能是通过幼虫的某些分泌性蛋白(即侵入相关因子)所介导的。本课题组前期通过旋毛虫肠道感染性幼虫与肌幼虫的抑制消减杂交c DNA文库,筛选出了一种分子量为46 k Da且具有水解酶活性的旋毛虫Nudix水解酶(Ts Nd),本论文采用减毒沙门氏菌介导Ts Nd基因进入小鼠体内表达,重组质粒通过真核表达载体进行携带,尽最大程度保证Ts Nd基因表达的蛋白与天然蛋白有相似性。以口服方式使Ts Nd重组沙门氏菌进入体内,之后侵入肠道黏膜淋巴组织,目的基因就可以在抗原递呈细胞中表达。Ts Nd重组菌免疫过程与旋毛虫天然感染阶段相似,含整个肠道阶段均同时以肠道为入侵起点。此外,本文还应用基因工程技术构建Ts Nd基因的重组真核表达质粒(即Ts Nd DNA肌肉注射疫苗),接种动物后观察其在体内的表达及其诱导的免疫应答与免疫保护效果。材料与方法1.旋毛虫虫种,载体,菌株,实验动物及细胞系旋毛虫(T1)由本教研室昆明小鼠传代保种。pc DNA3.1+载体质粒,大肠埃希菌(E.coli)JM109,由本实验室冻存保存。雌性4周龄BALB/c小鼠购自河南省实验动物中心。所用细胞系为乳仓鼠肾细胞BHK-21,来自河南省疾控中心细胞资源中心。鼠伤寒沙门氏菌"縞ya SL1344株由河南科技大学动物科技学院动物疫病与公共安全重点实验室惠赠。2 Ts Nd的克隆及真核表达载体的构建应用生物信息学与ORF Finder在线预测工具分析Ts Nd基因的ORF,Ts Nd基因从第111位到1358位,总长1248bp,编码415个氨基酸。设计并合成PCR引物,扩增出Ts Nd基因片段,将其插入到载体pc DNA3.1中构成重组质粒pc DNA3.1-Ts Nd,对其进行酶切以及测序鉴定正确后,将部分电转化入减毒沙门氏菌中,另一部分转化入大肠杆菌BL21中保存。3重组沙门氏菌的构建及其在小鼠体内的转录和表达在核酸水平,将Ts Nd基因电转化后的沙门氏菌液进行PCR鉴定,扩增后得到与理论值大小相符的Ts Nd基因条带,说明重组沙门氏菌"縞ya SL1344/pc DNA3.1-Ts Nd构建成功;其次对重组菌的体内转录水平进行检测,初次免疫后7d提取小鼠脾脏和肠系膜淋巴结RNA进行RT-PCR,同时在蛋白水平利用免疫荧光试验(IFA)检测Ts Nd在脾脏内的表达情况。4 Ts Nd重组质粒的鉴定应用改良贝氏法收集感染后35d的旋毛虫肌幼虫;提取旋毛虫总RNA逆转录获得c DNA。PCR反应获得1248bp的Ts Nd基因,将Ts Nd基因克隆到p MD19-T载体,通过Bam HI和Xho I双酶切及单酶切,用特异性引物进行PCR鉴定阳性克隆插入Ts Nd基因片段大小的正确性。然后将Ts Nd基因亚克隆到真核表达载体pc DNA3.1,构建重组质粒pc DNA3.1-Ts Nd。序列测定证实插入片段的正确性。此外,通过重组质粒转染BHK-21细胞,应用IFA检测Ts Nd在BHK-21细胞的表达。5 Ts Nd DNA疫苗免疫小鼠诱导的免疫应答对两种途径免疫的小鼠尾静脉采血,ELISA检测抗Ts Nd抗体Ig G,Ig G1及Ig G2a。收集免疫小鼠的肠道冲洗液检测肠道分泌型Ig A,收集脾细胞检测细胞因子IFN-γ,IL-2,IL-4及IL-10。经口免疫组通过IFA检测肠道冲洗液中特异性Ig A对旋毛虫不同发育期虫体的识别,而质粒肌肉注射组则通过IFA检测免疫血清Ig G对旋毛虫不同期虫体的识别。6 Ts Nd DNA疫苗免疫小鼠诱导的免疫保护将240只小鼠BALB/c随机分为6组(每组40只):分别对DNA疫苗口服组与肌肉注射组、空菌与空质粒对照组,两个PBS组分别口服与肌肉注射接种免疫4次,每次免疫间隔2周;末次免疫后7d,每只小鼠经口攻击感染300条旋毛虫肌幼虫。攻击感染后7d与35d天分别剖杀小鼠,收集旋毛虫成虫与肌幼虫,观察肠道期成虫与肌幼虫数,计算其减虫率。结果1.通过Bam HI和Xho I酶切,PCR鉴定及测序结果证实,成功构建了重组真核表达质粒pc DNA3.1-Ts Nd。2.RT-PCR结果显示Ts Nd基因在免疫小鼠脾脏和肠系膜淋巴结进行了转录;IFA结果表明Ts Nd基因在免疫小鼠的脾脏和肠系膜淋巴结均有表达。3.重组质粒pc DNA3.1-Ts Nd转染BHK-21细胞后,IFA检测发现Ts Nd基因在BHK-21细胞中表达;Western blot分析表明在BHK-21细胞中表达的Ts Nd蛋白可被旋毛虫感染血清以及Ts Nd重组蛋白免疫血清所识别。4.血清抗体检测结果表明,DNA疫苗口服与肌肉注射组的特异性Ig G水平均是在第2次和第3次免疫后明显升高,并在末次免疫后1周达到峰值,而在对照组及PBS空白对照组则无明显改变。在初次免疫后的第4周和第6周,血清中的Ig G1水平明显高于Ig G2a水平,Ig G2a水平在第2次免疫后及攻击感染前均有非常明显增高,表明DNA疫苗口服或肌肉注射免疫小鼠均诱导产生了以Th2型免疫反应为主的Th1/Th2混合型免疫反应。5.DNA疫苗口服与肌肉注射组小鼠肠道总Ig A及特异性Ig A水平与免疫前相比均有明显升高;IFA结果表明免疫小鼠的肠道分泌型Ig A与血清Ig G均可识别旋毛虫不同期虫体。细胞因子检测显示,DNA疫苗口服与肌肉注射组的IFN-γ,IL-2,IL-4及IL-10均明显高于对照组(P0.05),且免疫后4种细胞因子水平持续升高,口服与肌肉注射组均在初次免疫后第8周达到峰值,表明DNA疫苗口服与肌肉注射均诱导了Th1/Th2混合型免疫反应。6.Ts Nd DNA疫苗口服免疫组的成虫减虫率(73.32%)和肌幼虫减虫率(49.5%)明显高于空菌对照组(Fadults=54.049,Flarvae=15.066,P0.05);肌肉注射免疫组的成虫减虫率(40.44%)和肌幼虫减虫率(53.9%)亦明显高于空质粒照组(Fadults=43.265,Flarvae=14.598,P0.05)。结果表明Ts Nd DNA疫苗口服与肌肉注射免疫小鼠均可诱导部分免疫保护作用,口服组的成虫减虫率高于肌肉注射组(χ2=22.54,P0.01),但2种免疫途径的肌幼虫减虫率的差异无统计学意义(χ2=0.406,P0.05)。结论1.成功构建了重组质粒pc DNA3.1-Ts Nd。2.将pc DNA3.1-Ts Nd电转化减毒沙门氏菌后经口免疫小鼠或将pc DNA3.1-Ts Nd肌肉注射免疫小鼠,均可诱导特异性的肠道分泌型Ig A及Th1/Th2混合型免疫反应。3.Ts Nd DNA疫苗口服与肌肉注射免疫小鼠均可产生部分免疫保护作用,但口服组的成虫减虫率明显高于肌肉注射组,肌幼虫减虫率的差异无统计学意义。
【关键词】：旋毛虫 Nudix水解酶 DNA疫苗 分泌型IgA 细胞因子
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R392-33
【目录】：
- 摘要4-8
- Abstract8-16
- 英文缩略词16-17
- 第一部分 旋毛虫TsNd基因的减毒沙门氏菌运载体口服DNA疫苗研究17-64
- 1 前言17-20
- 1.1 旋毛虫及旋毛虫病17-18
- 1.2 旋毛虫TsNd基因介绍18
- 1.3 减毒沙门氏菌作为疫苗运载体研究18-19
- 1.4 研究的目的和意义19-20
- 2 实验材料方法20-42
- 2.1 主要试剂20
- 2.2 常用仪器20-21
- 2.3 主要试剂的配置21-28
- 2.4 旋毛虫虫种和实验动物28
- 2.5 旋毛虫各期虫体的收集28-29
- 2.6 减毒沙门氏菌培养29
- 2.7 真核TsNd重组质粒的构建与电转化沙门氏菌29-35
- 2.8 TsNd重组蛋白的表达与纯化35-36
- 2.9 TsNd重组沙门氏菌体内体外转录与表达检测36-38
- 2.10 TsNd重组沙门氏菌对宿主免疫系统影响的研究38-41
- 2.11 旋毛虫肌幼虫攻击感染小鼠41-42
- 2.12 统计学处理42
- 3 结果42-58
- 3.1 旋毛虫TsNd基因生物信息学分析42-43
- 3.2 提取旋毛虫肌幼虫总RNA43-44
- 3.3 TsNd基因PCR扩增产物44-45
- 3.4 重组克隆载体pMD19-T-TsNd的构建及酶切鉴定结果45
- 3.5 重组克隆载体pMD19-T-TsNd测序鉴定序列分析45-46
- 3.6 重组表达载体pcDNA3.1-TsNd的构建及双酶切鉴定46-48
- 3.7 重组表达载体pcDNA3.1-TsNd电转减毒沙门氏菌鉴定48
- 3.8 重组沙门氏菌的稳定性鉴定48-49
- 3.9 重组沙门氏菌转染BHK-21 细胞（细胞形态学变化）49-50
- 3.10 重组沙门氏菌转染BHK-21 细胞（Western blotting结果）50-51
- 3.11 间接ELISA法检测免疫特异性血清的效价51-52
- 3.12 TsNd基因体内转录检测52
- 3.13 TsNd基因体内表达检测52-53
- 3.14 TsNd免疫血清IgG抗体及亚类滴度的测定53-54
- 3.15 肠道IgA检测54
- 3.16 肠道分泌型IgA对旋毛虫不同期虫体的识别54-56
- 3.17 细胞因子的检测56
- 3.18 旋毛虫肌幼虫攻击感染BALB/c小鼠的减虫率56-57
- 3.19 旋毛虫成虫形态学变化57-58
- 4 讨论58-60
- 5 结论60-61
- 参考文献61-64
- 第二部分 旋毛虫TsNd基因肌肉注射DNA疫苗研究64-81
- 1 前言64-65
- 1.1 寄生虫DNA疫苗的研究进展64
- 1.2 DNA疫苗肌肉注射免疫64-65
- 1.3 研究目的与意义65
- 2 实验材料方法65-68
- 2.1 旋毛虫虫种和实验动物65
- 2.2 TsNd重组质粒的构建及浓度测定65-66
- 2.3 TsNd重组质粒在体外BHK-21 细胞中的表达66
- 2.4 TsNd重组质粒对宿主免疫系统影响的研究66-68
- 2.5 旋毛虫肌幼虫攻击感染小鼠68
- 2.6 统计学处理68
- 3 结果68-75
- 3.1 TsNd重组质粒构建及体外表达验证68-69
- 3.2 TsNd重组质粒浓度测定结果69
- 3.3 间接ELISA法检测免疫特异性血清的效价69-70
- 3.4 TsNd重组质粒免疫血清IgG抗体及亚类滴度的测定70-71
- 3.5 血清IgG对旋毛虫不同期虫体的识别71-73
- 3.6 肠道IgA检测73
- 3.7 细胞因子的检测73-74
- 3.8 旋毛虫肌幼虫攻击感染小鼠的减虫率74-75
- 4 讨论75-77
- 5 结论77-78
- 参考文献78-81
- 综述 寄生虫DNA疫苗的研究进展81-96
- 参考文献92-96
- 个人简历、在读期间发表的论文96-97
- 致谢97
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