Ikaros家族蛋白异源表达、纯化及初步晶体学研究

发布时间：2017-06-23 19:16

  本文关键词：Ikaros家族蛋白异源表达、纯化及初步晶体学研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：白血病是造血系统的一种恶性疾病,目前在我国具有较高的发病率和死亡率,而且发病率还在不断攀升,因此与白血病发生相关的分子机制的研究备受关注。Ikaros家族蛋白是主要分布在血细胞中的一类转录因子蛋白,可调控血细胞分化发育中多种重要基因的转录和表达,对多种血细胞,尤其是淋巴系白细胞的发育有着重要影响。它们的表达或功能异常与多种血液系统恶性肿瘤高度相关。Ikaros家族蛋白的N端和C端各具有一组C2H2型锌指结构域：N端部分的四个锌指主要负责结合特定的DNA序列；而C端的两个锌指参与介导蛋白蛋白之间的相互作用,并对N端功能和蛋白寿命起到一定的调控作用。Ikaros家族蛋白可以从染色体、核小体、RNA聚合酶三个层面,通过直接结合目的基因的调控元件、招募染色质重塑复合物以及将目的基因调控区域募集至细胞核异染色质区域等方式,调控下游蛋白的转录。其中,C端锌指介导的蛋白蛋白相互作用对转录调控的完成起重要作用。本论文选取该家族的Ikaros 和 Aiolos的C端保守部分作为研究对象,进行质粒构建、表达、纯化及初步的晶体学研究。已获得的研究结果包括：1.通过分子克隆的方法成功构建了多种表达质粒。在原核系统中,质粒携带的编码基因能够表达出含有不同长度柔性连接区域的MBP融合蛋白,且经酶切验证,各融合蛋白呈现不同的酶切效果；2.根据目的蛋白的特异标签亲和性、表面电荷、疏水性、分子量及分子形状等特征,采取不同的层析方式分别对4BP-IkarosC/AiolosC 及 Ikaros/Aiolos的C端蛋白进行分离纯化,获得了大量高纯度的MBP-IkarosC/AiolosC融合蛋白；3.进一步实验证明Ikaros/Aiolos 的 C端蛋白可能与层析填料基质发生相互作用,导致目的蛋白难于洗脱纯化；4.针对MBP-IkarosC/AiolosC筛选得到多个潜在的晶体生长条件,完成初步条件优化,可重复性很强,目前实验仍在继续进行中。论文的另一部分对双孔钾离子通道TREK1进行了研究。该蛋白主要分布在中枢和外周神经系统中。TREK1属于机械门控性钾离子通道,同时受到化学或生理性刺激,包括脂质、磷酸化、温度、pH值等多种因素的调节。它在体内具有重要的生理意义,与神经保护、疼痛、麻醉、抑郁症等具有一定的相关性。哺乳动物双孔钾离子通道TREK1亚群以二聚的形式发挥功能,其单体具有典型的结构特征：4个跨膜片段(M1～M4),2个孔道区域(2P),胞浆内侧有较短的氨基端和较长的羧基端。有报道称,TREK1 C端部分是各种因素调控TREK1活性的一个重要部位。本论文以TREK1的C端蛋白部分作为研究对象,进行了一系列分子克隆、表达、纯化及初步晶体学实验。目前,利用pET28a、pET30a、pMAL、pFN18α等载体,分别连接不同长度TREK1C截短片段的编码基因,已成功构建11种表达质粒。通过诱导表达试验,筛选出表达较好且融合蛋白可溶性较高的pMAL-TREK1C质粒进行大量表达。选用MBP亲和层析及分子筛对MBP-TREK1C进行分离纯化,最终得到足量且纯度较高的融合蛋白。使用Index及Wizard两种结晶试剂盒进行晶体条件的初步筛选,结果尚在观察中。
【关键词】：Ikaros 锌指 TREK1 蛋白表达纯化
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R3411
【目录】：

• 缩略语4-7
• 摘要7-9
• Abstract9-11
• 前言11-15
• 文献综述15-38
• References29-38
• 实验材料38-47
• 实验方法47-60
• 1. 目的片段的获得47-49
• 2. 重组质粒的构建以及验证49-52
• 3. 重组质粒突变及验证52-53
• 4. 目的蛋白的表达纯化53-58
• 5. 蛋白结晶58-60
• 实验结果60-94
• 1. 含MBP标签的Ikaros/AiolosC质粒构建、纯化及结晶试验60-69
• 2. 不含MBP标签的Ikaros/AiolosC质粒构建及纯化试验69-85
• 3. TREK1C质粒构建、纯化及结晶试验85-94
• 总结与讨论94-98
• 参考文献98-100
• 致谢100-101
• 个人简历及在校期间的科研成果101-102

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本文编号：476061