粉尘螨1类变应原T和B细胞表位嵌合基因的构建、表达及特异性免疫治疗研究

发布时间：2017-06-26 09:21

  本文关键词：粉尘螨1类变应原T和B细胞表位嵌合基因的构建、表达及特异性免疫治疗研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的：构建编码粉尘螨1类变应原(Derfl) B的细胞表位与T细胞表位嵌合基因原核表达载体,并进行大规模表达纯化,以及探究重组变应原的特异性免疫治疗(Allergen Specific Immunotherapy, ASIT)效果。 方法1)将Derf1所包含的5个T细胞表位(T1-T5)与6个B细胞表位(B1～B6),按照B1-T1-B2-T2-B3-T3-B4-T4-B5-T5-B6和B1-B2-B3-B4-B5-B6-T1-T2-T3-T4-T5连接方式,直接合成表位嵌合基因,并分别命名为Derf1A和Derf1B。构建原核表达重组质粒pET-28a(+)-Derf1A和pET-28a(+)-Derf1B,通过经限制性内切酶BamH I/Xho I进行双酶切鉴定,并在测序验证的阳性后,克隆转化到E.coli BL21(DE3)中进行诱导表达。SDS-PAGE分析各表达的产物并纯化,同时利用Western bloting进行鉴定验证。ELISA检测法检测各表达的嵌合蛋白对粉尘螨过敏患者的血清IgE抗体的结合力。2)动物实验：把50只小鼠随机分为：A组：阴性对照组、B组：哮喘组、C组：Derf1治疗组、D组：重组融合变应原Derf1B治疗组、E组：重组融合变应原Derf1A治疗组等5组。其中哮喘组、Derf1治疗组、Derf1B治疗组和Derf1A治疗组小鼠用粉尘螨提取液于第1、7、14d进行3次腹腔注射致敏,并于第21d开始行雾化吸入激发,持续7d。其中治疗组于雾化吸入前30分钟,分别用Derf1、Der f1B、Derf1A进行特异性免疫治疗。对照组用磷酸盐缓冲液(PBS)进行腹腔注射及雾化吸入。完成雾化吸入激发实验后,分别进行：1计数支气管肺泡灌洗液(BALF)中白细胞总数：2观察肺组织病理切片；3检测BALF与脾细胞培养上清液(SSCS)中IL-5、IFN-γ;4血清中特异性IgE、IgG2a水平。 结果双酶切及测序的结果表明,成功构建了原核表达重组质粒pET-28a(+)-Der f1A与pET-28a(+)-Der f1B; SDS-PAGE分析表明,Derf1A与Der f1B成功诱导,并纯化成功。Western blotting的结果进一步证实纯化了Der f1A和Derf1B的嵌合蛋白。同时进行了大规模的纯化。与Derf1目比,发现Der f1A-与Derf1B嵌合蛋白和粉尘螨过敏患者的血清IgE抗体的结合能力显著降低(P0.01),但是Derf1A与Derf1B之间差异无统计学意义(P0.05)。用Der f1A和Derf1B嵌合蛋白分别对粉尘螨粗提取液致敏的小鼠哮喘模型进行特异性免疫治疗后,经ELISA法检测,结果表明：Derf1组、Derf1A和Derf1B组小鼠的肺部炎症比哮喘组明显减轻。Derf1组、Derf1A与Derf1B组小鼠肺泡灌洗液中白细胞总数和嗜酸性粒细胞数均明显降低,但Derf1组与Derf1A组、Derf1B组相比,没有明显的差异(P0.05)。ELISA法检测的各组小鼠SSCS与BALF中的IFN-γ与IL-5水平,结果显示：Derf1组、Derf1A组、Derf1B组和哮喘组比较,SSCS和BALF中IFN-γ含量则显著升高(P0.01),IL-5的水平明显降低(P0.01),Derf1组、Derf1A组、Derf1B组之间差异无统计学意义(P0.05)。Derf1组、Derf1A组、Derf1B组血清中变应原特异性IgE抗体的浓度降低显著(P0.01),Derf1组、Derf1A组、Derf1B组之间差异无统计学意义(P0.05)。IgG2a浓度则显著升高(P0.01), Derf1组、Derf1A组、Derf1B组之间差异无统计学意义(P0.05)。结论成功表达了Derfl的B和T细胞的表位嵌合蛋白,同时进行了大规模纯化；所表达的嵌合蛋白成功通过对尘螨过敏性哮喘模型的小鼠进行治疗,且在一定程度上可有效减轻哮喘模型的小鼠的肺部炎症。粉尘螨1类变应原的小分子低毒过敏原构建成功,为诊断和治疗过敏性哮喘奠定基础。
【关键词】：尘螨1类变应原 重组变应原 特异性免疫治疗 T细胞表位 B细胞表位
【学位授予单位】：安徽理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R384.4
【目录】：

• 摘要5-7
• Abstract7-13
• 注释说明清单13-17
• 引言17-20
• 第一部分 粉尘螨1类变应原T与B细胞表位嵌合基因的构建与表达20-46
• 1 研究内容20-21
• 1.1 基因合成20
• 1.2 设计引物20-21
• 2 材料与方法21-28
• 2.1 主要试剂21-23
• 2.2 主要试剂配置23-28
• 3 实验方法28-37
• 3.1 重组表达质粒的构建28
• 3.2 重组质粒的提取28-29
• 3.3 重组质粒的双酶切鉴定29-30
• 3.4 E.coli BL21(DE3)感受态细胞的制备及转化30
• 3.5 菌落PCR、筛选阳性菌及测序30-31
• 3.6 Derf1,Derf1A,Derf1B蛋白的小量诱导表达31
• 3.7 Derf1,Derf1A,Derf1B蛋白的SDS-PAGE分析31-33
• 3.8 Derf1,Derf1A,Derf1B蛋白的大量诱导表达33
• 3.9 Derf1,Derf1A,Derf1B蛋白的纯化及鉴定33-34
• 3.10 纯化产物的免疫印记(western blot)分析34
• 3.11 Bradford's法定量蛋白浓度34-37
• 4 结果37-44
• 4.1 重组融合表位基因Derf1A、Derf1B的PCR扩增37-38
• 4.2 重组质粒鉴定38-39
• 4.3 Derf1,Derf1A,Derf1B蛋白的SDS-PAGE分析39-41
• 4.4 Derf1,Derf1A,Derf1B重组蛋白的纯化41-42
• 4.5 纯化产物的免疫印迹(Western blot)鉴定42-43
• 4.6 重组蛋白的浓度测定43
• 4.7 Derf1B与Derf1A对粉尘螨过敏患者的血清IgE结合力43-44
• 讨论44-46
• 第二部分 Derf1A、Derf1B嵌合蛋白对哮喘小鼠免疫治疗的效果分析46-59
• 1 研究内容46-47
• 2 材料与方法47-48
• 2.1 材料与试剂47
• 2.2 实验材料47
• 2.3 主要试剂47
• 2.4 主要试剂配制47-48
• 3 实验步骤48-51
• 3.1 实验动物分组48
• 3.2 建立哮喘小鼠模型48-49
• 3.3 特异性免疫治疗49
• 3.4 实验标本取材及指标检测49-50
• 3.4.1 血清特异性IgE和IgG2a抗体含量的测定49
• 3.4.2 脾细胞培养49-50
• 3.4.3 肺组织切片HE染色50
• 3.4.4 支气管肺泡灌洗液(BALF)中特异性细胞因子检测50
• 3.5 统计学方法50-51
• 4 结果51-57
• 4.1 各组小鼠症状与体征的改变51
• 4.2 ELISA法测定血清中特异性IgE和IgG2a的含量51-52
• 4.3 ELISA法测定小鼠脾细胞培养上清液中抗原特异性IL-5和IFN-γ的含量52-54
• 4.4 肺组织切片HE染色54
• 4.5 ELISA法检测支气管肺泡灌洗液(BALF)中特异性细胞因子IL-5和IFN-γ的含量54-55
• 4.6 BALF中细胞分类计数55-57
• 5 讨论57-59
• 结论59-60
• 参考文献60-67
• 致谢67-69
• 作者简介及读研期间主要科研成果69

【参考文献】

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  本文关键词：粉尘螨1类变应原T和B细胞表位嵌合基因的构建、表达及特异性免疫治疗研究，由笔耕文化传播整理发布。

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本文编号：485637