普通棉耳狨猴MHC-I限制性等位基因抗原分子特征分析

发布时间：2017-06-27 08:09

  本文关键词：普通棉耳狨猴MHC-I限制性等位基因抗原分子特征分析，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：普通棉耳狨猴属新世界小型灵长类动物,与绢毛猴同属狨科,原产于中美洲北部。狨猴由于体小、易于管理、繁殖率较高、费用低、易在实验室内笼养等优点,自七十年代起被广泛应用于生命科学多学科领域的研究,如人类脑发育、内分泌学、行为学、免疫学、畸胎学、病毒学、病毒肿瘤学和生殖生物学等。先前研究表明,GBV-B可以感染普通棉耳狨猴,引起它们类似人类病毒性肝炎的症状。而HCV与GBV-B很近似,同属黄病毒科肝病毒属。故本课题组提出科学假设：以HCV的基因替换GBV-B相应基因构建嵌合病毒是否也能感染狨猴?针对此假设,本课题组以HCV1b的完整囊膜蛋白(HCV-E1E2p7)和HCV完整结构蛋白(HCV-CE1E2p7)置换GBV-B的相应功能区构建了两种嵌合病毒HCV-CE1E2p7/GBV-B、HCV-E1E2p7/GBV-B,实验证明两种病毒均能够感染狨猴,病毒均能在肝细胞内进行复制及表达并能释放到外周血中,嵌合病毒感染的狨猴可产生针对HCV病毒的特异性免疫反应,为我们提供了一个新型的用于研究HCV病毒与宿主相互作用、研发HCV疫苗及抗HCV药物的能够替代黑猩猩的小型动物模型,建立的嵌合病毒狨猴感染模型能够更准确真实地模拟HCV在灵长类动物体内的活动状态。然而在此实验中,不同的个体感染病毒后虽都可以造成持续感染,但是不同个体的病毒载量、持续时间、肝脏损伤程度都有所不同。而在检测狨猴针对HCV的T细胞免疫反应实验时中也证实不同个体对同一表位多肽T细胞免疫反应不同。这应该与不同个体的免疫反应有关。而主要组织相容性复合体Ⅰ类(MHC-I)抗原分子的多态性决定了狨猴针对病毒的特异性细胞免疫反应的抗原限制性。随机挑选的遗传背景未知的狨猴感染HCV可能造成个体间的免疫应答有所不同。如果狨猴间具有相同的MHC-I等位基因,可能提呈相同的抗原肽,引起的免疫反应也会类似。故实验可挑选MHC-I类等位基因相同的狨猴进行同一实验保证实验的稳定性和可重复性。但在人类和鼠、恒河猴等实验动物的MHC-I分子研究已经相当深入的同时,狨猴的MHC-I类分子研究才刚刚起步。因此,揭示狨猴MHC-I类等位基因及其抗原分子的特性,有助于后续挑选狨猴作为实验动物时保证实验的稳定性和重复性,丰富狨猴MHC-I类分子遗传背景信息,为后续了解狨猴对HCV特异性细胞免疫保护反应的分子机制和疫苗免疫研究提供重要信息。主要组织相容性复合体(MHC)是由一群紧密连锁的基因群组成,定位于动物和人类染色体的特定区域,呈现复杂的多态性,且所有的基因均为共显性表达。MHC分子是参与免疫细胞发育、抗原提呈和识别以及免疫应答的关键成分。在病毒感染细胞后合成的病毒蛋白、肿瘤细胞合成的肿瘤抗原以及胞内某些正常成分等内源性抗原所引起的T细胞介导的免疫反应中,MHC-Ⅰ类分子与抗原肽结合成复合物,经高尔基体转运至细胞表面,提呈给CD8+T细胞。由于不同MHC-I类等位基因产物的分子结构各异,使不同个体对特定抗原的应答能力存在差异。因此清晰的MHC-I类分子遗传背景对病毒感染后个体特异性细胞反应和肿瘤疾病机体应答的研究具有重要作用。普通棉耳狨猴作为实验动物模型,清晰的MHC遗传背景资料对于其在医学的应用有较大的辅助作用。但到目前为止,对普通棉耳狨猴MHC的研究还很有限。本研究从3只用来研究HCV/GBV-B感染模型的普通棉耳狨猴中克隆、分离出了MHC-I类等位基因分子全长重链和轻链p2m的mRNA基因,对已确定的12只狨猴MHC-I类等位基因序列进行了详细的分析,并挑选了在狨猴中的优势MHC-I类等位基因进行表达,同时分析了MHC轻链β2m的序列,阐明了狨猴MHC-I类蛋白的结构特征,并尝试制备了狨猴MHC-I/肽可溶性单体。此研究丰富了狨猴MHC-I类分子遗传背景,为狨猴模型更好的应用打下基础。如后续增大样本量,我们期望发现大部分狨猴共有的等位基因,构建MHC-I四聚体对狨猴HCV感染模型中机体产生的抗原特异性T细胞进行深入的研究。目的：此研究旨在揭示普通棉耳狨猴MHC-I类和β2m基因的特征,阐明狨猴MHC-I类蛋白的结构特征,丰富狨猴的MHC-I类分子背景资料,提高后续挑选狨猴作为实验动物时的稳定性和重复性,为后续了解狨猴对HCV特异性细胞免疫保护反应的分子机制和疫苗免疫研究提供重要信息。方法：1：研究对象普通棉耳狨猴common marmosets (Callithrix jacchus)3只,雄性,体重300-400g左右/只。2：实验方法(1)普通棉耳狨猴MHC-I重链蛋白分子制备：采用RT-PCR技术从狨猴PBMC中扩增MHC-I类等位基因全长,根据单倍型克隆数≥2的原则,确定能编码完整蛋白的MHC-I类等位基因。利用DNAMAN5.2.2软件对等位基因的序列进行综合比对,并将等位基因的碱基序列翻译为氨基酸序列后比对,利用MEGA4.1软件制作系统进化树进行狨猴等位基因分析。挑选出现频率最高的等位基因,并在其羧基端加上BSP基因后插入原核表达载体中进行表达,SDS-PAGE、WB鉴定表达情况。镍柱纯化。(2)普通棉耳狨猴MHC-I链β2-microglobulin蛋白分子制备：采用RT-PCR技术从狨猴PBMC中扩增β2m的mRNA基因。用DNAMAN和DNAstar软件对序列进行分析,并与其他灵长类动物及不同物种的β2m进行同源性比对、系统进化分析。亚克隆β2m成熟肽基因,插入原核表达载体pET-28a(+)中,并通过SDS-PAGE和WB鉴定其表达。镍柱纯化。(3)普通棉耳狨猴MHC-I-BSP和β 2m成熟肽结构分析及可溶性单体制备和鉴定：运用BioEdit和DNAstar对MHC-I-BSP蛋白以及p2m成熟肽蛋白一级结构进行分析,Protscale程序进行蛋白疏水性分析,ANTHEPROT程序进行蛋白质理化特性分析,NetPHos2.0 Server进行蛋白质磷酸化位点分析。用圆二色谱、SOPMA和PredictProtein软件对蛋白二级结构进行预测。利用SWISS-MODEL程序对蛋白进行同源建模分析。采用Altman首创的四聚体制备方法尝试了狨猴MHC-I/肽可溶性单体的制备。结果：(1) MHC-I重链蛋白分子制备从3只普通棉耳狨猴PBMC中克隆的MHC-I类等位基因扩增产物全长为1100bp左右,共得到了116个MHC-I等位基因克隆,根据单倍型克隆数≥2的原则,从中确定了7个能编码为完整蛋白的Caja-G等位基因和1个假基因。新确定的MHC-I类等位基因均被划分为Caja-G型等位基因。将序列翻译为氨基酸序列后与人的HLA-G进行比对,可见Caja-G等位基因序列呈现高度的多态性。狨猴MHC-I类等位基因序列包含胞外段(α1-a3),跨膜段和胞内段,胞外段。远膜端αl、α2结构域其氨基酸排列顺序变化较大,共同构成了抗原结合槽,是Ⅰ类分子多态性的基础。近膜端的α3结构域氨基酸序列较为保守。挑取了加上之前本课题组研究的总共12只狨猴中出现频率最高的等位基因Caja-G*09:03作为需要表达的蛋白. Caja-G*09:03携带率相对较高,预期Caja-G*09:03构建的四聚体具有较好的可行性和应用前景。并通过PCR技术将BirA酶底物肽(BSP)基因连接到了Caja-G*09:03胞外域的羧基端,Caja-G*09:03胞外域-BSP插入原核表达载体pET-28a(+)中,鉴定其表达后进行了条件优化使其大量表达。Caja-G*09:03-BSP(MHC-I-BSP)蛋白分子大小约34kDa。包涵体洗涤溶解后,SDS-PAGE结果显示包涵体纯度较纯。由于缺乏针对狨猴Caja-G的单克隆抗体,此处采用针对His标签的抗体检测蛋白表达。Western Blot显示蛋白大小与SDS-PAGE一致。并用镍柱对蛋白进行了纯化。(2) MHC-I轻链(β2-microglobulin蛋白分子制备克隆的β2m的mRNA基因全长为357bp,前20个氨基酸为信号肽部分,后99个氨基酸为成熟肽部分,与GenBank中普通棉耳狨猴β2m的mRNA序列(XM一002753411.2)同源性为100%,证明了其高度保守性。亚克隆了p2m基因的成熟肽部分,将β2m基因的成熟肽基因插入原核表达载体pET-28a(+)中进行蛋白表达。SDS-PAGE结果显示蛋白大小约为12kDa,与理论预测值一致。采用针对狨猴β2m的单克隆抗体和His标签抗体对蛋白进行了鉴定,分子大小一致,说明β2m正确表达。用镍柱对蛋白进行了纯化。(3)蛋白结构分析及可溶性单体制备和鉴定普通棉耳狨猴MHC-I-BSP蛋白(Caja-G*09:03-BSP)和β2m成熟肽蛋白预测分子量分别为33.63KDa和11.60KDa。与之前原核表达的结果一致。其理论假设的等电点pI分别为5.085和7.355。MHC-I-BSP蛋白疏水性为1.389,β2m成熟肽蛋白疏水性为1.122。棉耳狨猴MHC-I-BSP蛋白存在着21个潜在的磷酸化位点,β2m蛋白8个潜在的磷酸化位点。SOPMA预测的MHC-I-BSP蛋白以α-螺旋、p-折叠和随机卷曲为主。PredictProtein预测的MHC-I-BSP蛋白α-螺旋占据22.3%,p-折叠为32.6%,其他结构为45%。β2m成熟肽蛋白SOPMA预测的蛋白二级结构主要以p-折叠和随机卷曲为主,其中最主要的结构元件为β-折叠,占43.43%,α-螺旋最少,仅4.04%。PredictProtein预测的结果与SOPMA结果基本一致,其不含α-螺旋,β-折叠比例为45.5%。圆二色谱仪(JASCO J-810)测定CD值与软件预测存在较大的差异。蛋白同源建模分析显示狨猴MHC-I-BSP蛋白的3D结构与人的HLAⅠ的3D结构相似,由2个反向平行的α螺旋和8个p片层组成,具有一个抗原结合槽。a3由7条p片层组成。β2m蛋白的3D结果与人的β2m蛋白的3D结构类似,由7个p片层组成,无α螺旋。采用Altman首创的四聚体制备方法尝试了狨猴MHC-I/肽可溶性单体的制备,为进一步制备MHC-I/肽四聚体做准备。选取前期实验狨猴T细胞反应检测中具有强反应性的HCV E1 (El-282)和已报道的人HLA-A2优势表位肽NS3(CV9)构建Caja-G*09:03限制性的MHC-I/肽可溶性单体,但折叠后复合物经HPLC和ELISA鉴定后未发现有单体形成,在优化反应条件及改变浓缩方式、纯化方法后均未发现单体形成。对此结果进行了分析。结论：(1)利用RT-PCR技术从3只普通棉耳狨猴PBMC中扩增了MHC-I类等位基因重链和β2m基因,并对加上之前本课题组研究的总共12只狨猴的MHC-I类等位基因序列进行了详细的分析,丰富了狨猴MHC-I类等位基因遗传背景。(2)亚克隆了Caja-G*09:03胞外域和β2m成熟肽基因,在Caja-G*09:03胞外域羧基端连接上了BSP基因,使其羧基端可以成功标记上生物素,为下一步构建狨猴的MHC四聚体研究奠定了基础。(3)将狨猴Caja-G*09:03胞外域-BSP基因和β2m成熟肽基因连接至pET-28a(+)原核表达系统,进行了原核表达并对其表达条件进行了优化,蛋白以包涵体的形式进行了高效表达。并用镍柱进行了纯化。(4)运用测序所得基因序列推导的氨基酸序列和生物信息学软件、圆二色谱(CD)对狨猴Caja-G*09:03胞外域-BSP基因和β2m成熟肽的一级结构和二级结构进行分析,并运用同源建模构建了狨猴Caja-G*09:03胞外域-BSP基因和β2m成熟肽蛋白的三级结构(3D)模型。蛋白质结构分析为狨猴HCV/GBV-B嵌合病毒模型CD8+T细胞免疫反应的研究提供了遗传背景和重要信息。(5)采用Altman首创的且是目前最常用于MHC-I/肽四聚体制备的技术对普通棉耳狨猴Caja-G*09:03限制性的MHC-I/肽四聚体制备进行了尝试。虽经HPLC和ELISA鉴定无单体形成,但本实验对未形成单体原因进行了分析,并为后续的实验提供了清晰的方向。
【关键词】：普通棉耳狨猴 MHC-Ⅰ类分子β2m 蛋白表达 结构分析 可溶性单体
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R392
【目录】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-18
• 前言18-33
• 第1章 普通棉耳狨猴MHC-Ⅰ重链蛋白分子制备33-66
• 1.1 材料33-38
• 1.2 方法38-50
• 1.3 结果50-62
• 1.4 讨论62-66
• 第2章 普通棉耳狨猴MHC-Ⅰ轻链β2-microglobulin蛋白分子制备66-78
• 2.1 材料66
• 2.2 方法66-68
• 2.3 结果68-76
• 2.4 讨论76-78
• 第3章 普通棉耳狨猴MHC-Ⅰ-BSP和β2m成熟肽结构分析及可溶性单体制备和鉴定78-94
• 3.1 材料78-79
• 3.2 方法79-82
• 3.3 结果82-90
• 3.4 讨论90-94
• 全文总结94-95
• 参考文献95-101
• 攻读学位期间成果101-102
• 致谢102-103

【参考文献】

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1 胡苏玮;钟燕芳;吴菁;麦明琴;周才;江玮;;胎儿血清β_2微球蛋白水平与宫内病毒感染的关系[J];中国优生与遗传杂志;2013年05期

  本文关键词：普通棉耳狨猴MHC-I限制性等位基因抗原分子特征分析，，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：489036