Toll样受体-3和-4对干细胞成软骨分化的影响及机制

发布时间：2017-07-01 15:22

  本文关键词：Toll样受体-3和-4对干细胞成软骨分化的影响及机制，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的探索Toll样受体(Toll Like Receptor,TLR)-3和-4在骨髓间充质干细胞(Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells,BMSCs)成软骨分化的过程中对蛋白多糖和II型胶原蛋白形成的影响及机制。方法用Ficoll密度梯度离心法分离SD大鼠BMSCs,并进行传代扩增。流式细胞术检测细胞表面标志物CD34、CD44、CD54、CD90的表达进行细胞鉴定。取活力好的第3代BMSCs作为实验对象,在正式分组干预前,首先以Western blot法检测蛋白多糖和II型胶原的表达,作为后续试验的比较基线。再将BMSCs随机分为空白组、TLR-3激活组、TLR-4激活组,分别以PBS、TLR-3激动剂(Poly[I:C],SIGMA P9582-5MG 1μg/ml)、TLR-4激动剂(LPS,SIGMA L2630-10MG1μg/ml)处理后。三组细胞均进行成软骨诱导分化培养。培养第14天,以阿利新蓝染色检测蛋白多糖的形成,以免疫荧光及Western blot法检测II型胶原的表达,以实时荧光定量PCR检测Sox-9的表达。结果以Ficoll密度梯度离心法成功分离得到成纤维样贴壁生长的细胞,流式细胞技术检测表面标志物表达,结果为CD34(—)、CD44(+)、CD54(+)、CD90(+),符合BMSCs表面标志物表达特点,证实分离培养所得细胞为大鼠BMSCs。分组处理前,细胞并不表达蛋白多糖及II型胶原,BMSCs在化学组成上并不表现出成软骨细胞的特性。经过2周成软骨分化诱导培养,空白组、TLR-3激活组和TLR-4激活组均生成了蛋白多糖,阿利新蓝染色均为阳性,计数并比较发现,三组间阳性细胞数差异无统计学意义(F=0.628,P=0.5470.05)。免疫荧光及Western-blot结果显示,三组均表达II型胶原,但空白组表达明显低于TLR-3激活组和TLR-4激活组(t3=3.993,P3=0.0030.05;t4=7.650,P4=0.0000.05),而后两组间无明显差异(t=0.934,P=0.3720.05)。PCR结果显示,TLR-3和TLR-4激活组Sox-9相对表达量分别是对照组Sox-9表达量的2.2倍和2.14倍,差异具有统计学意义(t3=4.47,P3=0.000.05;t4=3.61,P4=0.020.05),而前两组之间Sox-9的表达量无明显差异(t=1.12,P=0.270.05)。结论经过成软骨诱导分化培养,大鼠BMSCs能够形成基质蛋白多糖及II型胶原,初步具有软骨细胞特性。TLR-3和TLR-4对基质蛋白多糖的形成无明显作用,却能够促进II型胶原的形成,其机制可能是TLR-3和-4对Sox-9表达的上调作用。
【关键词】：Toll样受体 骨髓间充质干细胞 成软骨分化 蛋白多糖 II型胶原
【学位授予单位】：江苏大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R68
【目录】：

• 摘要5-7
• Abstract7-11
• 第一章 引言11-14
• 第二章 大鼠骨髓间质干细胞（Ficoll密度梯度离心法）、传代培养及细胞表面标志物的联合鉴定14-24
• 1.前言14-15
• 2.实验目的15
• 3.实验材料15-17
• 3.1. 实验动物15
• 3.2. 实验试剂和仪器15-16
• 3.3. 实验试剂的配置16-17
• 4. 实验方法17-19
• 4.1. 大鼠BMSCs的分离及原代培养17-19
• 4.2. 细胞流式技术检测BMSCs特异性表面标志物19
• 5. 实验结果19-21
• 5.1. 大鼠BMSCs的形态及分布19-20
• 5.2 细胞流式技术检测 BMSCs 特异性表面标志物20-21
• 6. 结果讨论21-24
• 第三章 Toll样受体-3 和-4 对干细胞成软骨分化的影响和机制24-44
• 1. 前言24
• 2.实验目的24-25
• 3.实验材料25-30
• 3.1. 细胞系25
• 3.2. 实验试剂/试剂盒25
• 3.3. 实验仪器及器材25-26
• 3.4.实验试剂的配置26-30
• 4.实验方法30-35
• 4.1. 大鼠BMSCs细胞系的获取30-31
• 4.2.成软骨诱导前蛋白多糖和II型胶原的检测31-32
• 4.3. 试验分组处理及成软骨诱导32-33
• 4.4. 成软骨诱导后蛋白多糖和II型胶原的检测33
• 4.5. 实时荧光定量PCR检测Sox-9 基因33-35
• 5. 实验结果35-39
• 5.1. 成软骨诱导前蛋白多糖及II型胶原的表达35-36
• 5.2. 成软骨诱导后蛋白多糖及II型胶原的变化36-38
• 5.3. TLRs对Sox-9 基因表达的影响38-39
• 6. 讨论39-44
• 参考文献44-51
• 致谢51-53
• 在学期间发表的学术论文及其它学术成果53-55
• 综述：TLR在微生物识别到自噬中的重要作用55-73
• 参考文献63-73
• 附录：主要略缩词一览表73-74

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本文编号：506469